توصيف أنظمة تدفق الأدوية المتعددة في الراكدة البوماني باستخدام سلالة بكتيرية تعاني من نقص التدفق ونظام التعبير الجيني أحادي النسخة
Summary
وصفنا إجراء سهلا لتكملة الكروموسومات أحادية النسخة لجين مضخة التدفق باستخدام نظام تعبير صغير قائم على Tn7 في سلالة مهندسة تعاني من نقص التدفق من Acinetobacter baumannii. تسمح هذه الأداة الجينية الدقيقة بالتعبير الجيني الخاضع للرقابة ، وهو أمر أساسي لتوصيف مضخات التدفق في مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة.
Abstract
يتم التعرف على Acinetobacter baumannii كممرض صعب سالبة الجرام بسبب مقاومته الواسعة للمضادات الحيوية. من الأهمية بمكان فهم الآليات الكامنة وراء هذه المقاومة لتصميم خيارات علاجية جديدة وفعالة. لسوء الحظ ، فإن قدرتنا على التحقيق في هذه الآليات في A. baumannii يعوقها ندرة أدوات التلاعب الجيني المناسبة. هنا ، نصف طرق استخدام نظام قائم على الكروموسومات المصغرة Tn7 لتحقيق التعبير الجيني أحادي النسخة في سلالة A. baumannii التي تفتقر إلى آليات التدفق الوظيفية من نوع RND. يعد إدخال نسخة واحدة وتعبير مضخة التدفق المستحث مفيدا جدا ، حيث أن وجود operons تدفق RND على البلازميدات ذات العدد العالي غالبا ما تتحمله الخلايا البكتيرية بشكل سيئ. علاوة على ذلك ، فإن دمج متجهات التعبير الصغيرة Tn7 المؤتلفة في كروموسوم مضيف بديل A. baumannii مع زيادة حساسية التدفق يساعد على التحايل على التداخل من مضخات التدفق الأخرى. هذا النظام ذو قيمة ليس فقط للتحقيق في مضخات التدفق البكتيري غير المميزة ولكن أيضا لتقييم فعالية المثبطات المحتملة التي تستهدف هذه المضخات.
Introduction
Acinetobacter baumannii هو أحد مسببات الأمراض ذات الأولوية القصوى لمنظمة الصحة العالمية نظرا لمقاومته الشاملة لجميع فئات المضادات الحيوية1. إنه ممرض انتهازي يؤثر في الغالب على الأشخاص في المستشفى أو المصابين أو الذين يعانون من نقص المناعة. A. baumannii يتهرب إلى حد كبير من المضادات الحيوية عن طريق مضخات التدفق ، وأكثرها صلة هي عائلة مصدري قسم المقاومة (RND)2. إن فهم كيفية عمل مضخات التدفق هذه ميكانيكيا سيسمح للمرء بتطوير خيارات علاجية مستهدفة.
إحدى الطرق الشائعة التي يمكن من خلالها تمييز العمليات الخلوية على وجه التحديد هي من خلال التلاعب الجيني. ومع ذلك ، فإن الأدوات المتاحة للدراسات الجينية A. baumannii محدودة ، ولزيادة إرباك التصميم التجريبي ، غالبا ما تكون العزلات السريرية مقاومة للمضادات الحيوية المستخدمة بشكل روتيني للاختيار في التلاعب الجيني3. العقبة الثانية التي تمت مواجهتها عند دراسة مضخات التدفق على وجه التحديد هي أنها منظمة بشكل صارم – غالبا بعوامل غير معروفة – مما يجعل من الصعب عزل الوظيفة بدقة وعزوها إلى مضخة واحدة4. نظرا لهذه الحاجة إلى توسيع صندوق أدوات البحث ، قمنا بتطوير نظام تعبير قابل للحث قائم على TN7 ، وإدراج نسخة واحدة ، يشتمل على كاسيت هدف Flp recombinase (FRT) ، والذي يسمح بإزالة علامة التحديد5،6،7 (الشكل 1). تم إنشاء نظام الاستنساخ والتعبير الأنيق هذا لأول مرة ل Pseudomonas8،9،10 ، وقد تم استخدامه لتوليد مكملات مضخة تدفق أحادية النسخة في سلالة تعاني من نقص مضخة تدفق RND من A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK ، ΔadeFGH ، ΔadeAB: يشار إليها فيما يلي باسم A. baumannii AB258) التي أنشأناها11. القدرة على دراسة مضخة تدفق واحدة في كل مرة وعدم إرباك الخلايا البكتيرية بتعبير عالي النسخ (كما هو موضح عموما مع أنظمة التعبير القائمة على البلازميد) ، يمكن للمرء أن يتعلم بشكل أفضل عن الجوانب الفسيولوجية الحرجة لكل مضخة تدفق مع الحد الأدنى من التداخل وتقليل المضاعفات.
توضح هذه المقالة كيفية استخدام نظام mini-Tn7 لاستكمال جين محذوف من الأهمية ، مضخة تدفق RND adeIJK ، في كروموسوم A. baumannii AB258 من خلال سلسلة من الخطوات غير المعقدة التي يتم إجراؤها على مدار 9 أيام7. تعيد المجموعة الأولى من الخطوات إدخال جينات مضخة التدفق المحذوفة المستنسخة في بلازميد الإدخال المصغر القائم على Tn7 (الشكل 2A) في موقع إدخال attTn7 الفردي في اتجاه مجرى جين glmS المحفوظ جيدا (الشكل 3A). يتم تسهيل هذه العملية من خلال بلازميد مساعد غير متماثل (الشكل 2 ب) يشفر جينات الترانسبوزاز اللازمة للإدخال المدفوع ب Tn7. تستخدم المجموعة الثانية من الخطوات بلازميد الاستئصال (الشكل 2C) لإزالة جين الجنتاميسين بوساطة Flp المجاور بمواقع FRT (الشكل 3B) لإنشاء سلالة غير مميزة. على الرغم من أن هذا النظام يستخدم لتوضيح الأدوار الأساسية والمثبطات المحتملة لمضخات تدفق RND فيما يتعلق بمقاومة المضادات الحيوية ، إلا أنه يمكن استخدامه للتحقيق في أي جين مهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن هذا الإجراء الخاص بالإدخال الكروموسومي لنظام التعبير الجيني أحادي النسخة القابل للحث في A. baumannii واضح تقنيا وليس كثيف العمالة ، إلا أن هناك بعض الخطوات المهمة التي يجب التأكيد عليها. أولا ، يجب أن يتم تحضير الخلايا المختصة على الجليد قدر الإمكان حيث تصبح الخلايا هشة أثن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة اكتشاف من مجلس العلوم الطبيعية والهندسة في كندا إلى AK. يتم إنشاء المخططات المستخدمة في الأشكال باستخدام BioRender.com.
Materials
| 0.2 mL PCR tube | VWR | 20170-012 | For colony boil preparations and PCR reactions |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72-690-301 | General use |
| 13-mL culture tubes, Pyrex | Fisher | 14-957K | Liquid culture vessels |
| 6x DNA loading buffer | Froggabio | LD010 | Agarose gel electrophoresis sample loading dye |
| Acetic acid, glacial | Fisher | 351271-212 | Agarose gel running buffer component |
| Agar | Bioshop | AGR003 | Solid growth media |
| Agarose | BioBasic | D0012 | Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2% |
| Agarose gel electrophoresis unit | Fisher | 29-237-54 | Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products |
| Carbenicillin | Fisher | 50841231 | Selective media |
| Culture tube closures | Fisher | 13-684-138 | Stainless steel closure for 13-mL culture tubes |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set | Biobasic | DD0058 | PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP |
| Dry bath/block heater | Fisher | 88860023 | Isotemp digital dry bath for boil preparations |
| Electroporation cuvettes | VWR | 89047-208 | 2 mm electroporation cuvettes with round cap |
| Electroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz electroporator |
| Ethidium bromide | Fisher | BP102-1 | Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Agarose gel running buffer component |
| Gentamicin | Biobasic | GB0217 | For the preparation of selective media |
| Glycerol | Fisher | G33 | Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer |
| Incubator (shaking) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth |
| Incubator (static) | Fisher | 11-690-550D | Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth |
| Inoculation loop | Sarstedt | 86.1562.050 | Streaking colonies onto agar plates |
| Inoculation spreader | Sarstedt | 86.1569.005 | Spreading of culture onto agar plates |
| Lysogeny broth (LB) broth, Lennox | Fisher | BP1427 | Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract) |
| Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples |
| Mini-centrifuge | Fisher | S67601B | Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes |
| Petri dishes | SPL Life Sciences | 10090 | For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm |
| Pipettes | Mandel | Various | Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Power supply | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic power supply for electrophoresis |
| Primers | IDT | NA | PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet |
| Sucrose | BioBasic | SB0498 | For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii |
| Taq DNA polymerase | FroggaBio | T-500 | PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer |
| Thermal cycler | Biorad | 1861096 | Model T100 for PCR |
| Toothpicks | Fisher | S24559 | For patching colonies onto agar plates |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Agarose gel running buffer component |
| Ultrapure water | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing |
| Wide range DNA marker | Biobasic | M103R-2 | Size determination of PCR products on an agarose gel |
| Wooden inoculating sticks | Fisher | 29-801-02 | Inoculating cultures with colonies from agar plates |
References
- Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017)
- Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
- Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380 (2020).
- Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
- Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
- Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
- Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
- Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
- Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
- Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288 (2021).
- Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
- Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
- Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373 (2021).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).
- Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
- Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).
- Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
- Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
- Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
- Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).
- Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16 (2020).
