Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri yetkililer tarafından onaylanmıştır (lisans 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) ve yerel yönergelere (Tierschutz-Verordnung, Basel) ve İsviçre hayvan koruma yasasına (Tierschutz-Gesetz) uygundur. 1. Enfekte dokuların hazırlanması ve saklanması Tercih ettiğiniz bir enfeksiyon modeli kullanın. Burada, her iki cinsiyetten 10 ila 16 haftalık fareler, intravenöz enjeksiyon ile ~ 1.000 koloni oluşturan birim (CFU) veya yuvarlak uçlu bir iğne ile intragastrik uygulama ile 5 x 107 CFU ile enfekte edilir. Uygun fare türleri arasında BALB/c ve C57BL/6 bulunur.NOT: Aynı yaklaşım diğer konukçu türler için de kolayca uyarlanabilir. Boyanmamış dokuda tanımlamayı sağlamak için patojenlerin floresan proteinleri eksprese ettiğinden emin olun. GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 veya mWasabi16 eksprese eden patojenlerin tümü 940 nm uyarma17 kullanılarak görselleştirilebilir. Akış sitometrisi19 ile kolayca tespit edilebilen seviyelerde mCherry18 eksprese eden Salmonella, 800 nm uyarma kullanılarak görüntülenebilir, ancak enfekte dalak ve karaciğerde önemli otofloresan gösteren zayıf sinyal-arka plan oranlarına sahiptir. Akış sitometrisi ile kantifikasyona dayalı olarak nötr pH’ta paraformaldehit ile fiksasyondan sonra tüm floresan proteinlerin floresan yoğunluklarının %>70’ini koruduğundan emin olun. Burada enfekte fare dokusu, yani dalak, karaciğer, lenf düğümleri ve Peyer yamaları kullanılır. Perfüzyondan 10 dakika önce fikoeritrin (PE) etiketli antikorları enjekte ederek konak hücre yüzey belirteçlerini in vivo olarak boyayın. Nötrofilleri boyamak için, 100 μL PBS’de intravenöz olarak 4 μg anti-Ly-6G-PE enjekte edin. Dalaktaki marjinal zon makrofajlarını boyamak için, 100 μL PBS’ye 4 μg anti-CD169-PE enjekte edin (bkz. Enfekte dokuları standart transkardiyal perfüzyon20 ile 15 mL buz gibi soğuk 50 mM fosfat tamponu (PB; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7.4) ile sabitleyin, ardından PB’de 35 mL% 4 paraformaldehit (PFA; fiksatif) (Şekil 1A).Kısaca, enfekte hayvana 100 mg / kg ketamin ve 16 mg / kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu ile derin anestezi uygulayın. Ayak parmağını kıstırma refleksinin kaybını onaylayarak uygun anesteziyi sağlayın. Kürkü% 70 etanol kullanarak dezenfekte edin, steril bir kağıt havluyla kurulayın ve göğsü cımbız ve makasla cerrahi olarak açın. Kalbin sol ventrikülüne steril bir iğne yerleştirin, sağ atriyumu steril makasla açın ve ilk tamponu ve ardından sabitleyiciyi bir pompa kullanarak iğne, sol ventrikül ve tüm vasküler sistemden geçirin. Bu, tüm dokuları hızlı ve düzgün bir şekilde sabitler ve ötenaziye neden olur. Perfüzyondan sonra dokuyu toplayın, PB tamponunda 20x hacimde% 4 soğuk paraformaldehit içinde inkübe edin ve gece boyunca 4 ° C’de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin (Şekil 1B). 0,05 ila 2cm3 boyut aralığındaki dokular için görüntüleme mümkündür. Daha büyük dokular için uygun parçalar halinde kesin. Ertesi gün, PFA’yı çıkarmak için dokuyu 3 kez 10 dakika boyunca PB tamponu ile oda sıcaklığında 40 rpm’de çalkalayarak yıkayın.NOT: PFA toksisitesi nedeniyle, bu adımlar bir çeker ocak içinde gerçekleştirilmelidir. PFA atıklarını kurumsal yönergelere göre atın. Fazla PB tamponunu çıkarın ve 20x hacimde kriyoprotektan depolama tamponu21 (876 mM sükroz, 0.25 mM polivinilpirolidon, (h/h) etilen glikol, 50 mM PB tamponunda çözülmüş) numuneye 4 ° C’de 40 rpm’de 6-8 saat çalkalayarak veya dokular dibe çökene kadar ekleyin. Doku otofloresansının etkili bir şekilde azaltılmasını sağlamak için numuneleri en az 3 gün boyunca -20 °C’de inkübe edin11. Numuneler -20 °C’de saklandığında 5 yıla kadar kullanılabilir.NOT: Dokunun batması, depolama tamponunun dokuya uygun şekilde nüfuz ettiğini gösterir. 2. Örnek gömme Bir vibratom ile düzgün kesim için dokuyu bir agaroz bloğuna gömün. agarozu periodat ile oksidasyon yoluyla kimyasal olarak önceden aktive edin ve daha sonra kesme işlemi sırasında daha iyi stabilite için doku ile çapraz bağ oluşturmak üzere borohidrit ile azaltın. Aşağıda açıklanan adımları gerçekleştirin. 2.25 g agaroz ağırlığında% 4 oksitlenmiş agaroz hazırlayın ve 0.21 g NaIO4 ekleyin. Agaroz ve NaIO4’e 100 mL PB ekleyin. Işıktan koruyarak 2-3 saat davlumbazda oda sıcaklığında karıştırın.NOT: Kritik adım: Karıştırmayı 3 saatten fazla aşmayın, aksi takdirde agaroz zayıf bir şekilde polimerize olur. Agarozu, 0,2 μm membranlı standart bir vakum filtresinde membran filtrasyonu ile geri kazanın. Kalan NaIO4’ü 3x’i 50 mL PB tamponu ile yıkayarak çıkarın. Oksitlenmiş agarozu 50 mL PB tamponunda yeniden süspanse edin.NOT: Bu aşamada agarozu eritmeyin. Agaroz 4 °C’de 2-3 haftaya kadar ışıktan korunarak saklanabilir. 1 L suya 19 g boraks ve 3 g borik asit ekleyerek borohidrür çözeltisi hazırlayın. Eriyene kadar karıştırın ve pH’ı 1 M NaOH ile 9-9,5’e ayarlayın. Çeker ocaktaki bir karıştırma plakasında 100 mL borat tamponunu 40 °C’ye ısıtın. 0,2 g NaBH4 ekleyin ve ışıktan koruyarak 15-30 dakika karıştırın.NOT: Borohidrür çözeltisi karanlıkta oda sıcaklığında birkaç hafta saklanabilir. Kritik adım: Borat tamponuna NaBH4 eklenirken gaz oluşacaktır, bu nedenle bu adımı bir çeker ocak içinde gerçekleştirin. Patlamaya neden olabileceğinden bu adımı sıkıca kapatılmış bir kapta yapmayın. Azaltılmış otofloresan (≥ 3 gün) için yeterli inkübasyondan sonra dondurucudan doku alın, fazla kriyoprotektan depolama tamponunu çıkarın ve dokuyu oda sıcaklığında (RT) 40 rpm’de çalkalayarak PB tamponu ile her biri 10 dakika boyunca 3x yıkayın. Yaklaşık 20 mL oksitlenmiş agaroz süspansiyonunu (adım 1’de hazırlanır) bir mikrodalgada (~30 s için 700 W) eritin, işleyecek kadar soğumasını bekleyin (~ 45 ° C) ve plastik bir kalıba dökün.NOT: Kritik adım: Agarozu numune üzerindeki mikrodalgada ısıttıktan hemen sonra eklemeyin, bu dokunun tahrip olmasına neden olabilir. Dokuyu nazikçe almak için bir cımbız kullanın ve hızlı bir şekilde agarozun alt ortasına yerleştirin. Agarozun polimerize olmasına izin vermek için kalıbı RT’de 15 dakika inkübe edin. Agaroz polimerizasyonunu takiben, plastik kalıbı dört köşesinden bir neşter ile açın ve agaroz küpünü eldivenli parmaklarla dikkatlice alın. Oksitlenmiş agaroz ve dokunun çapraz bağlanmasını başlatmak için numuneyi 4 ° C’de 2-3 saat boyunca borohidrür çözeltisine (adım 2’de hazırlanır) daldırın. Bu, kesit alma sırasında dokunun ayrılmasını önler.NOT: Kritik adım: Borohidrür içine daldırılmış numune, 4 °C’de ışıktan korunarak inkübe edilmelidir. Agaroz küpünü PB tamponu 2x ile 10 dakika yıkayın. Agaroz küpünü, doku üst tarafta olacak şekilde çevirin ve bloğu birkaç damla anında yapıştırıcı kullanarak manyetik bir slayta (arkaya iki mıknatıs takılı mikroskop slaytı) tutturun. Yapıştırıcının katılaşması 10-20 dakika sürer, bu nedenle agarozun üzerine PB tamponu damlaları içeren bir kağıt mendil yerleştirin ve numunenin baştan sona yeterince nemli kalmasını sağlayın (Şekil 1C). 3. Mikrotomun hazırlanması ve sahnenin hazırlanması Manyetik slaytı, tomografinin numune kutusunun ortasındaki metalin üzerine yerleştirin. Kutuyu PB tamponu ile doldurun ve dikkatlice sahneye yerleştirin ve numune kutusunu tomografi tablasına sabitlemek için soldaki vidayı sıkın.NOT: Vidaları aşırı sıkmayın, aksi takdirde plastik kutuya zarar verir. Bıçağı mikrotomun üzerine yerleştirin ve numunenin konumunu dikkatlice mikrotomun yakınına ve altına kaydırın. Agarozun üst yüzeyi, mikrotomun bıçağı ile aynı seviyede olmalıdır.NOT: Çok alçakta konumlandırmak kesme süresini boşa harcarken, çok yükseğe yerleştirmek ilk kesimde bloğun büyük bir kısmını kaldıracaktır. agaroz küpünü hedefin merkezine konumlandırmak için sahneyi hareket ettirin ve tüm agaroz küpünün sağlam bir dilimini elde edene kadar tomografi yazılımındaki Dilim düğmesine art arda tıklayın. 4. Yüzeyin tahsisi ve 2D görüntülerin elde edilmesi Objektif lensi doku örneği üzerinde x ve y yönlerinde ortalayın. Lazer yazılımını açın ve yazılımdaki lazeri açın. Bir tıkırtı sesi duyduğunuzda lazer anahtarını açın ve dalga boyunu 800 nm’ye ayarlayın.NOT: Görüntülemeden önce lazer kaynağının en az 30 dakika, ideal olarak 1 saat ısıtılması gerekir. Mikroskobun kabin kapılarını kapatın, odadaki tüm ışık kaynaklarını kapatın ve PMT’leri açın ve voltajı 750 V’a ayarlayın.NOT: Kritik adım: PMT’ler ışığa karşı çok hassastır, dolap kapıları kapatılmadıkça ve odadaki tüm ışık kaynakları kapatılmadıkça ışığı kapalı tutun. Tomografi yazılımının protokol ayarlarını belirtildiği gibi ayarlayın ve mikroskop deklanşörünü otomatik olarak ayarlayın ve voltajı V20 ve V3 için sırasıyla 1 ve 2’e ayarlayın. Örneğin bir fotoğrafını çekmek için tomografi yazılımındaki 2D düğmesine tıklayın. Görünür otofloresanslı bir görüntü göründüğünde, agaroz küp yüzeyindeki odak düzlemini ayarlamak için z-piezo’yu ayarlayın. İlk tarama, numunenin sabit bir görüntüsünü elde etmek için yüzeyin 20 μm altında olacaktır.Otofloresan arka planı görünmüyorsa, bir sinyal görünene kadar kontrastı artırın. Görünür bir sinyal olmadığı ortaya çıkabilir (yani, dokunun üstündeki agaroz nedeniyle). Bu durumda, z-piezo cihazını kullanarak z-eksenini agaroz yüzeyine ulaşana kadar ayarlayın. İstenen konum z-piezo cihazının menzili dışındaysa, lensin manuel olarak hareket ettirilmesi gerekebilir. Numunenin yüzeyini bulduktan sonra birden fazla 50 μm’lik dilim kesin ve odak düzleminin blok yüzey yüzeyine düzgün bir şekilde ayarlandığından emin olmak için her kesimden sonra 2D görüntüler elde edin. 5. Numunelerin kenarlarının bulunması ve lazerin başlangıç noktasına ayarlanması Lazer tarama alanının xy koordinatlarına (4 köşe koordinatı) dayanarak, çevredeki agaroz bloğunun minimal görüntülemesi ile görüntüleme alanını doku ile sınırlayın. PMT’leri kapatın, lazer dalga boyunu 800 nm’ye ayarlayın, lazer deklanşörünü açmak için değiştirin. Agaroz bloğuna giren lazer ışığının konumu, dağınık ışıktan oluşan kırmızı bir nokta olarak görülebilir (Şekil 2A,B).Kritik adım: Sınıf 4 lazere özellikle dikkat edin. İnsan dokularına ve gözlerine hızla zarar verebilir. Personelin böyle bir cihazı güvenli bir şekilde çalıştırması için özel eğitime ihtiyacı vardır. Geri, sağ, ön ve sol sırayı kullanarak doku kenarlarının koordinatlarını bulmak için sahneyi kaydırırken lazer noktasını kullanın. Koordinatları iki kez kontrol edin ve lazer noktasını, dokuyu görüntülemek için varsayılan başlangıç noktası olan sağ ön köşeye yerleştirin. Konsol penceresindeki koordinatları, xy adımlarıyla tanımlanan, makine tarafından tanınabilir blok boyutlarına dönüştürün. Bu adım ölçümlerini yazılımın protokolüne girin. Dolap kapaklarını kapatın. 6. 3D tarama / kesit alma GFP, mWasabi veya YPet ve PE’yi uyarmak için dalga boyunu 940 nm’ye değiştirin.NOT: Lazer bu dalga boyunda insan gözüyle görülemez. GFP, mWasabi ve TIMERbac’ın yeşil yayan bileşeni için sinyalden arka plana gelişmek için, PMT 510’nin önüne 20/2 nm’lik dar bir bant geçiren filtre koyun. Bu, yeşil-sarı doku otofloresansının neden olduğu paraziti azaltır. Mikroskop deklanşörünü otomatik moda ve deklanşör voltajı ayarlarını V20 için 1 ve V1.71 için 2’e getirin. Yazılımda aşağıdaki üç parametreyi ayarlayın: Kesit kalınlığı- çoğu amaç için 50 μm’ye ayarlayın. Karaciğer için, sınırlı görüntüleme derinliği nedeniyle 30 μm’ye ayarlayın. Fiziksel bölümlerin sayısı- bu, görüntülenecek toplam doku derinliğini belirler ve buna göre ayarlanır. Her bölüm için yakalanacak uçak sayısı – bu, z çözünürlüğünü belirleyecektir. Çoğu amaç için 5 düzlem (10 μm dikey çözünürlük sağlar) kullanın. Karaciğer için 3 veya daha az düzlem kullanın. Lazer kazancını ayarlayın. Bunun farklı dokular ve tarama derinliği için ampirik olarak test edilmesi gerekir. Alınan görüntüleri depolamak için klasör yolunu ve adını tanımlayın ve görüntüleme meta dosyası için uygun bilgileri sağlayın. Girilen tüm değerleri iki kez kontrol edin. Tarama işlemini başlatmak için 3D mozaik ayarına tıklayın (Şekil 1D). Görüntüleme tamamlandıktan sonra, doku kesitlerini su tankından dikkatlice toplayın ve daha fazla kullanana kadar -20 °C’de depolama tamponunda saklayın (Şekil 1E; Şekil 2C,D). 7. Görüntü işleme ve veri analizi MATLAB komut dosyalarını https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020’dan bir Linux bilgisayara indirin. Komut dosyalarını bir klasöre kopyalayın, örneğin, /home/user/Program/.NOT: Komut dosyasının tam olarak işlevsel olması için MATLAB ve Fiji (veya ImageJ) için Computer Vision Toolbox eklentisinin Linux bilgisayarlara yüklenmesi gerekir. Döşeme görüntülerini aşağıda açıklandığı gibi dikin.Tomografi sunucusundan Linux bilgisayara veri aktarın. StepOneStitchingAndArchive.m MATLAB komut dosyasını açın ve ham verileri içeren kaynak klasörü bulun. Komut dosyasındaki kaynak ve hedef klasörleri tanımlayın. Düzenleyici sekmesine geçin ve Çalıştır’a tıklayın. İlerleme bilgisi komut penceresinde görüntülenir. İşleme, Mozaik dosyasından bilgi okumayı, görüntü birleştirmeden önce döşeme indeksi oluşturmayı, Cidre22 (Şekil 3) ile arka plan aydınlatma düzeltmesini ve farklı derinliklerde elde edilen optik katmanlar arasındaki aydınlatma düzeltmesini içerir. Dikişli görüntüleri, kaynak klasördeki stitchedImages_100 adlı bir alt klasörde bulun. tar komutunu kullanarak ham verileri uzun süreli depolama için sıkıştırın ve tar.bz2 dosya adı uzantısıyla tek bir dosya olarak kaydedin (Şekil 1F). Destek vektör makinesi ile model eğitimi ve segmentasyon gerçekleştirin. Destek vektör makinesini eğitmek ve segmentasyonu gerçekleştirmek için aşağıdaki adımları izleyin.NOT: Üç floresan kanalının her biri için dikişli görüntüler, stitchedImages_100’nin 3 alt klasöründe (kırmızı, turuncu ve yeşil floresansa karşılık gelen 1, 2 ve 3 adlı) saklanır. Her alt klasör, aynı kanaldan eklenen tüm görüntüleri içerir.Dikişli görüntüleri önizleyin. Fiji (veya ImageJ) ile her alt klasörden aynı dosya adına sahip bir görüntü açın. Üç kanalı tek bir renkli görüntüde birleştirin. Bakteri ve doku otofloresansından net sinyaller görene kadar her kanalın parlaklığını ayarlayın. Bir sonraki adım için her kanalın ayarlanan maksimum yoğunluk seviyesini not edin. StepTwoSegmentationAndAnalysis.m MATLAB betiğini açın ve kaynağa göz atın. Eğitim için kaynak klasörü ve görüntü adlarını tanımlayın. MeselasourceD = ‘/’ ;red_name = [kaynakD ‘1/section_020_01.tif’]; green_name = [kaynakD ‘2/section_020_01.tif’];blue_name = [kaynakD ‘3/section_020_01.tif’]; Düzenleyici sekmesine gidin ve Çalıştır’a tıklayın. Renk eşiklerini soran bir iletişim kutusu görünecektir, Fiji ile önceki manuel kontrole göre doldurun (adım 7.3.1). İletişim kutularına göre arka plan bölgelerini ve ilgi alanlarını (yani bakteriler) seçin. Modelin ne kadar iyi eğitildiğini gösteren ve daha fazla bölge eklenmesi gerekip gerekmediğini soran grafikler görünecektir. Bakteriler net bir şekilde bölümlere ayrılana kadar daha fazla ilgi alanı ve arka plan ekleyin (Şekil 4A,B). Modeli adlandırın ve kaydedin. Komut dosyası görüntüleri otomatik olarak yükleyecek ve bir medyan filtre (yarıçap 2 piksel) uygulayacaktır. Segmentasyon işlemi otomatik olarak çalışır ve ilerleme bilgileri komut penceresinde gösterilir. Segmentasyonun ilerlemesini izleyin. Segmentasyon, diğer dikişli görüntülerde modelle iyi çalışmıyorsa, daha fazla arka plan ve bakteri bölgesi eklemek için model eğitimini tekrarlayın. Segmentasyonun sonuçlarını görmek için Allpositions_filter3D.txt adlı dosyayı kontrol edin. Bu dosya, her bakteri veya bakteri mikrokolonisi için ağırlık merkezinin koordinatlarını ve karşılık gelen entegre floresan yoğunluğunu içerir (Şekil 1G). Aşağıda açıklandığı gibi evrişimli sinir ağı ile ek yapıtları kaldırın.NOT: Bazı bakteriler için, Destek Vektör Makinesi ile basit segmentasyon hala bazı görüntüleme artefaktları içerir. Bu özellikle YPet eksprese eden bakteriler için geçerlidir. Sinir ağı tabanlı segmentasyon, bu artefaktları verimli bir şekilde kaldırabilir (Şekil 4C). Komut dosyasının tamamen işlevsel olması için MATLAB ve Fiji (veya ImageJ) için Görüntü İşleme Araç Kutusu eklentisinin Windows bilgisayarlara yüklenmesi gerekir. Altta yatan sinir ağı hakkında daha fazla bilgi için bkz.: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.htmlGörüntüleri hazırlayın. Fiji kullanarak tif dosyalarını farklı parlaklık ayarlarıyla jpg dosyalarına dönüştürün. Manuel iyileştirme ile en az 600 bakteri ve 600 artefaktı tanımlayın ve bu nesnelerin güvenli kırpılmış görüntülerini uygun klasörlerde bulun. CNNtestV4.m MATLAB komut dosyasını açın ve adım 7.4.1’deki nesne görüntülerini içeren kaynak dosyalara göz atın. Eğitim için görüntü klasörünü tanımlayın. MeseladigitDatasetPath = fullfile (‘D:\20200602_CNN’,’fortrainingPixel12Folder2′);Eğitim için görüntü sayısını tanımlayın, örneğin, numTrainFiles = 600. Düzenleyici sekmesine gidin ve Çalıştır’a tıklayın. Eğitimden sonra, CNN model dosyası kaynak klasöre gregnet1.mat olarak kaydedilir. Test görüntülerini içeren bir klasör tanımlayın. MeseladigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).Sonuçlar, görüntü adı ve bakteri veya artefakt olarak sınıflandırma hakkında bilgi içeren bir dosya YourFile.txt kaydedilir. Test görüntüleri ile klasör tanımlayın. MeseladigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).Sonuçlar, görüntü adı ve bakteri veya artefakt olarak sınıflandırma hakkında bilgi içeren bir dosya YourFile.txt kaydedilecektir. Aşağıda açıklandığı gibi tek bakterilerin floresan yoğunluğuna dayalı olarak mikro kolonilerin boyutunu tahmin edin.NOT: Tomografinin uzamsal çözünürlüğü, yoğun şekilde paketlenmiş mikrokoloniler içindeki tek tek bakteri hücrelerini çözmek için yetersizdir. Bununla birlikte, her bir mikrokolonideki bakteri sayısı, tek bir bakterinin floresansına bağlı olarak mikrokoloninin toplam floresansına dayalı olarak tahmin edilebilir. Bu tahmin doğruluğu, bakteri popülasyonu boyunca floresan yoğunluğunun homojenliğine bağlıdır.Tomografiden alınan kesitlerin immünohistokimyasını kullanarak lipopolisakkarit gibi bakteriyel bileşenleri boyayarak STP tomografisindeki GFP pozitif olayların kimliğini doğrulayın (Şekil 1H; Şekil 5). En az 30 tek bakteriyi tanımlayın ve ilgili segmentasyon sonuçlarından floresan yoğunluklarını alın. Medyan yoğunluk değerini tek bir bakteri için referans olarak kullanın. Mikrokoloninin toplam floresan yoğunluğunu tek bir bakteri için referans değere bölerek her bir mikrokoloninin bakteri sayısını hesaplayın (Şekil 1I). Aşağıda açıklandığı gibi görselleştirme yazılımı ile 3B rekonstrüksiyon gerçekleştirin.Görüntü hazırlamaDoku kapsülleri, arterler ve trabeküller dahil olmak üzere yararlı bir anatomik referans sağlayan ikinci harmonik kollajen sinyallerini içeren mavi kanal görüntülerini alın. 2. kanal olarak bakteriler için bölümlere ayrılmış görüntüleri kullanın. 1. kanaldaki görüntüleri hem x hem de y eksenlerinde 10 kat depolayın ve küçültülmüş görüntüleri yeni bir klasöre kaydedin. Aynı klasör içinde küçültülmüş görüntülerin 3 kopyasını oluşturun. Yeni çoğaltmaların adı aynı sırayı korumalıdır. Örneğin: section_001_01.tif, 1’i section_001_01-copy.tif adıyla çoğaltın, section_001_01-copy-copy.tif. Bu adımları 2. kanaldaki görüntülere de uygulayın. Küçültme, daha yönetilebilir dosya boyutları sağlar. Üçlü görüntüler z eksenini yumuşatacaktır. Fiji ile görüntü yığınları oluşturmak için her kanaldaki görüntüleri birleştirin. Görüntü > Yığınlar > Araçlar > Yığın sıralayıcı > Etiketlere göre sırala’yı tıklayın. 3D filtreleme gerçekleştirin. 3D filtre > Filtreler > İşle’ye tıklayın ve Z filtresi boyutunu 6 olarak ayarlayın. Görüntü yığınlarını kaydedin. Aşağıda açıklandığı gibi 3B görselleştirme gerçekleştirin.Görselleştirme yazılım paketini Arena görünümünde açın (varsayılan ayar). Arena görünümüne klasör eklemek için İzleme klasörü simgesini kullanın. *.ims veya *.tif dosyasını açmak için çift tıklayın (7.6.1’de hazırlanmıştır). Edit>Image Properties’i (Görüntü Düzenleme) kullanarak, Display Adjustment (Görüntü Ayarlama) penceresindeki farklı kanalların renk temsillerini (LUT’ler) ayarlayın. Min/maks değerlerini ve gama düzeltmesi için bir değeri manuel olarak ayarlamak için Gelişmiş’e tıklayın.Adları ve LUT’ları değiştirmek için Kanal adlarına tıklayın. Görüntünün görünümünü ayarladıktan sonra, Anlık Görüntü aracını kullanarak geçerli görünümü dışa aktarın. 3D verileri bir film olarak göstermek için Animasyon simgesini kullanın. Bir perspektif/görünüm bulmak için Gezinti İşaretçisi’ni kullanın ve yakınlaştırın ve ana kareler eklemek için + Ekle’yi kullanın. Başka bir konuma gidin ve sonraki ana kareyi ekleyin. Filmi oluşturmak için Kırmızı kayıt düğmesine basın. İstediğiniz hedef klasöre ve dosya türüne kaydedin (Şekil 1J).