Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Alle hier beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door de autoriteiten (licentie 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) en volgen de lokale richtlijnen (Tierschutz-Verordnung, Basel) en de Zwitserse dierenbeschermingswet (Tierschutz-Gesetz). 1. Voorbereiding en opslag van geïnfecteerde weefsels Gebruik een infectiemodel naar keuze. Hier worden 10 tot 16 weken oude muizen van beide geslachten geïnfecteerd met ~1.000 kolonievormende eenheden (CFU) door intraveneuze injectie of 5 x 107 CFU door intragastrische toediening met een naald met ronde punt. Geschikte muizenstammen zijn onder meer BALB/c en C57BL/6.OPMERKING: Dezelfde aanpak kan gemakkelijk worden aangepast voor andere gastheersoorten. Zorg ervoor dat ziekteverwekkers fluorescerende eiwitten tot expressie brengen om identificatie in ongekleurd weefsel mogelijk te maken. Ziekteverwekkers die GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 of mWasabi16 tot expressie brengen, kunnen allemaal worden gevisualiseerd met behulp van 940 nm excitatie17. Salmonella die mCherry18 tot expressie brengt op niveaus die gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd door flowcytometrie19 , kan worden afgebeeld met behulp van 800 nm excitatie, maar heeft slechte signaal-achtergrondverhoudingen in geïnfecteerde milt en lever die substantiële autofluorescentie vertonen. Zorg ervoor dat alle fluorescerende eiwitten >70% van hun fluorescentie-intensiteit behouden na fixatie met paraformaldehyde bij neutrale pH op basis van kwantificering met flowcytometrie. Hier worden geïnfecteerd muizenweefsel, namelijk milt, lever, lymfeklieren en Peyer’s pleisters gebruikt. Kleurig de oppervlaktemarkers van de gastheercel in vivo door 10 minuten voor de perfusie fycoerythrin (PE)-gelabelde antilichamen te injecteren. Om neutrofielen te kleuren, injecteert u intraveneus 4 μg anti-Ly-6G-PE in 100 μL PBS. Om macrofagen in de marginale zone in de milt te kleuren, injecteert u 4 μg anti-CD169-PE in 100 μl PBS (zie Materiaaltabel). Fixeer geïnfecteerde weefsels door middel van standaard transcardiale perfusie20 met 15 ml ijskoude fosfaatbuffer van 50 mM (PB; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7,4), gevolgd door 35 ml 4% paraformaldehyde (PFA; fixeermiddel) in PB (Figuur 1A).Kortom, diepe anesthesie toedienen aan het geïnfecteerde dier door intraperitoneale injectie van 100 mg/kg ketamine en 16 mg/kg xylazine. Zorg voor een goede verdoving door het verlies van de teenknijpreflex te bevestigen. Desinfecteer de vacht met 70% ethanol, droog deze af met een steriele papieren handdoek en open de borst operatief met een pincet en een schaar. Plaats een steriele naald in de linkerventrikel van het hart, open het rechteratrium met een steriele schaar en laat de eerste buffer en vervolgens het fixeermiddel door de naald, de linkerventrikel en het hele vasculaire systeem lopen met behulp van een pomp. Dit fixeert alle weefsels snel en gelijkmatig en veroorzaakt euthanasie. Verzamel het weefsel na perfusie, incubeer het in 20x volume 4% koud paraformaldehyde in PB-buffer en plaats het een nacht op een shaker bij 4 °C (Figuur 1B). Beeldvorming is mogelijk voor weefsels in het groottebereik van 0,05 tot 2cm3. Snijd voor grotere weefsels in geschikte stukken. Was de tissue de volgende dag 3x gedurende 10 minuten met PB-buffer en schud op 40 tpm bij kamertemperatuur om PFA te verwijderen.OPMERKING: Vanwege de PFA-toxiciteit moeten deze stappen worden uitgevoerd in een zuurkast. Gooi het PFA-afval weg volgens de institutionele richtlijnen. Verwijder eventuele overtollige PB-buffer en voeg 20x volume cryoprotectieve opslagbuffer21 (876 mM sucrose, 0,25 mM polyvinylpyrrolidon, 40% (v/v) ethyleenglycol, opgelost in 50 mM PB-buffer) toe aan het monster door te schudden bij 40 rpm bij 4 °C gedurende 6-8 uur of totdat de weefsels naar de bodem zinken. Incubeer monsters bij -20 °C gedurende ten minste 3 dagen om een effectieve vermindering van de autofluorescentie van het weefsel te garanderen11. Monsters kunnen tot 5 jaar worden gebruikt wanneer ze worden bewaard bij -20 °C.OPMERKING: Het zinken van het weefsel duidt op een goede penetratie van de opslagbuffer in het weefsel. 2. Voorbeeld inbedding Plaats het weefsel in een agaroseblok voor soepel snijden met een vibratoom. Activeer de agarose chemisch door oxidatie met periodaat en reduceer vervolgens met boorhydride om een dwarsverbinding met het weefsel te vormen voor een betere stabiliteit tijdens het snijproces. Voer de onderstaande stappen uit. Bereid 4% geoxideerde agarose door 2,25 g agarose af te wegen en voeg 0,21 g NaIO4 toe. Voeg 100 ml PB toe aan de agarose en NaIO4. Roer op kamertemperatuur in een zuurkast gedurende 2-3 uur met bescherming tegen licht.OPMERKING: Kritieke stap: Overschrijd het roeren niet langer dan 3 uur, anders zal de agarose slecht polymeriseren. Recupereer de agarose door membraanfiltratie in een standaard vacuümfilter met een membraan van 0,2 μm. Verwijder de resterende NaIO4 door 3x te wassen met 50 ml PB-buffer. Resuspendeer de geoxideerde agarose in 50 ml PB-buffer.OPMERKING: Smelt de agarose tijdens deze fase niet. De agarose kan tot 2-3 weken beschermd tegen licht bij 4 °C worden bewaard. Bereid boorhydrideoplossing voor door 19 g borax en 3 g boorzuur toe te voegen aan 1 l water. Roer tot het is opgelost en pas de pH aan naar 9-9,5 met 1 M NaOH. Verwarm op een roerplaat in een zuurkast 100 ml boraatbuffer tot 40 °C. Voeg 0,2 g NaBH4 toe en roer gedurende 15-30 minuten terwijl het beschermt tegen licht.OPMERKING: De boorhydrideoplossing kan enkele weken bij kamertemperatuur in het donker worden bewaard. Kritieke stap: Bij het toevoegen van NaBH4 aan de boraatbuffer wordt gas gevormd, voer deze stap daarom uit in een zuurkast. Voer deze stap niet uit in een goed afgesloten container, omdat dit tot een explosie kan leiden. Haal het zakdoekje uit de vriezer na voldoende incubatie voor verminderde autofluorescentie (≥ 3 dagen), verwijder de overtollige opslagbuffer voor cryoprotectieve middelen en was het zakdoekje 3x gedurende 10 minuten elk met PB-buffer met schudden op 40 tpm bij kamertemperatuur (RT). Smelt ongeveer 20 ml geoxideerde agarosesuspensie (bereid in stap 1) in een magnetron (700 W gedurende ~30 s), laat het voldoende afkoelen om te hanteren (~45 °C) en giet het in een plastic vorm.OPMERKING: Kritieke stap: Voeg de agarose niet direct toe nadat deze in de magnetron op het monster is opgewarmd, dit kan leiden tot vernietiging van het weefsel. Gebruik een pincet om het weefsel voorzichtig op te pakken en steek het snel in het onderste midden van de agarose. Incubeer de mal 15 minuten bij RT om de agarose te laten polymeriseren. Open na agarosepolymerisatie de plastic mal met een scalpel uit de vier hoeken en pak de agarosekubus voorzichtig op met gehandschoende vingers. Dompel het monster 2-3 uur onder in een boorhydrideoplossing (bereid in stap 2) bij 4 °C om de verknoping van de geoxideerde agarose en het weefsel op gang te brengen. Dit voorkomt dat het weefsel loslaat tijdens het sectieren.OPMERKING: Kritieke stap: Het ondergedompelde monster in boorhydride moet worden geïncubeerd beschermd tegen licht bij 4 °C. Was de agarose blokje met PB buffer 2x gedurende 10 min. Draai de agaroseblokje zodat het weefsel zich aan de bovenkant bevindt en bevestig het blok met een paar druppels instantlijm op een magnetisch objectglaasje (microscoopglaasje met twee magneten aan de achterkant). Het duurt 10-20 minuten voordat de lijm is gestold, dus plaats een papieren zakdoekje met druppels PB-buffer op de agarose en zorg ervoor dat het monster voldoende gehydrateerd blijft (Figuur 1C). 3. Voorbereiding van de microtoom en het instellen van de toon Plaats de magnetische schuif op het metaal in het midden van de monsterdoos van de tomograaf. Vul de doos met PB-buffer en plaats deze voorzichtig op de tafel en draai de schroef aan de linkerkant vast om de monsterdoos op de tafel van de tomograaf vast te zetten.NOTITIE: Draai de schroeven niet te vast aan, anders beschadigt dit de plastic doos. Plaats het mes op de microtoom en verschuif de positie van het monster voorzichtig in de buurt van en onder de microtoom. Het bovenoppervlak van de agarose moet zich op hetzelfde niveau bevinden als het blad van de microtoom.OPMERKING: Als u het te laag plaatst, verspilt u snijtijd, terwijl als u het te hoog plaatst, een groot deel van het blok bij de eerste snede wordt verwijderd. Verplaats de tafel om de agarosekubus naar het midden van het doel te positioneren en klik herhaaldelijk op de Slice-knop in de tomograafsoftware totdat je een intact plakje van de hele agarosekubus krijgt. 4. Toewijzing van het oppervlak en het verkrijgen van 2D-beelden Centreer de objectieflens op het weefselmonster in x- en y-richtingen. Open de lasersoftware en zet de laser aan in de software. Als u een tikkend geluid hoort, zet u de laserschakelaar aan en stelt u de golflengte in op 800 nm.NOTITIE: De laserbron moet ten minste 30 minuten, idealiter 1 uur, worden opgewarmd voordat de beeldvorming wordt gemaakt. Sluit de kastdeuren van de microscoop, schakel alle lichtbronnen in de kamer uit en zet de PMT’s aan en stel de spanning in op 750 V.OPMERKING: Kritieke stap: PMT’s zijn erg gevoelig voor licht, houd het uit tenzij de kastdeuren gesloten zijn en alle lichtbronnen in de kamer zijn uitgeschakeld. Pas de protocolinstellingen van de tomograafsoftware aan zoals aangegeven en stel de microscoopsluiter in op automatisch en de spanning op 20 en 3 voor respectievelijk V1 en V2. Klik op de 2D-knop in de tomograafsoftware om een foto van het monster te maken. Zodra een afbeelding met zichtbare autofluorescentie verschijnt, past u de z-piëzo aan om het brandpuntsvlak op het oppervlak van de agarose-kubus in te stellen. De eerste scan bevindt zich 20 μm onder het oppervlak om een stabiel beeld van het monster te krijgen.Als er geen autofluorescentieachtergrond zichtbaar is, verhoog dan het contrast totdat er een signaal verschijnt. Het kan voorkomen dat er geen zichtbaar signaal is (d.w.z. vanwege de agarose bovenop het weefsel). Pas in dit geval de z-as aan met behulp van het z-piëzo-apparaat totdat deze het agarose-oppervlak bereikt. Handmatige beweging van de lens kan nodig zijn als de gewenste positie zich buiten het bereik van het z-piëzo-apparaat bevindt. Snijd meerdere plakjes van 50 μm na het vinden van het oppervlak van het monster en maak na elke snede 2D-beelden om ervoor te zorgen dat het brandpuntsvlak goed is ingesteld op het oppervlak van het blokoppervlak. 5. De randen van de monsters vinden en de laser instellen op het startpunt Op basis van de xy-coördinaten van het laserscangebied (4 hoekcoördinaten), beperkt u het beeldvormingsgebied tot het weefsel met minimale beeldvorming van het omringende agaroseblok. Schakel de PMT’s uit, stel de lasergolflengte in op 800 nm, zet de lasersluiter op open. De positie van het laserlicht dat het agaroseblok binnenkomt, is zichtbaar als een rode vlek van verstrooid licht (Figuur 2A,B).Kritieke stap: Wees bijzonder voorzichtig met de klasse 4 laser. Het kan menselijke weefsels en ogen snel beschadigen. Het personeel heeft een speciale opleiding nodig om zo’n instrument veilig te bedienen. Gebruik de laserspot tijdens het verschuiven van de werktafel om de coördinaten van de weefselranden te vinden met behulp van de volgorde achter, rechts, voor en links. Controleer de coördinaten nogmaals en plaats de laserspot in de rechtervoorhoek, het standaard startpunt voor het afbeelden van het weefsel. Zet de coördinaten van het consolevenster om in machineherkenbare blokgroottes, die worden gedefinieerd door de xy-stappen. Voer deze stapmetingen in het protocol van de software in. Sluit de kastdeuren. 6. 3D scannen / segmenteren Verander de golflengte in 940 nm om GFP, mWasabi of YPet en PE te exciteren.OPMERKING: De laser is op deze golflengte onzichtbaar voor het menselijk oog. Om de signaal-naar-achtergrond voor GFP, mWasabi en de groene emitterende component van TIMERbac te verbeteren, plaatst u een smalbanddoorlaatfilter 510/20 nm voor PMT 2. Dit vermindert interferentie door autofluorescentie van groengeel weefsel. Zet de sluiter van de microscoop in de automatische modus en de instellingen van de sluiterspanning op 20 voor V1 en 1.71 voor V2. Pas de volgende drie parameters aan in de software: Doorsnededikte- voor de meeste doeleinden, ingesteld op 50 μm. Voor de lever ingesteld op 30 μm vanwege de beperkte beelddiepte. Het aantal fysieke secties – dit bepaalt de totale weefseldiepte die wordt afgebeeld, dienovereenkomstig ingesteld. Het aantal vlakken dat voor elke sectie moet worden vastgelegd – dit bepaalt de z-resolutie. Gebruik 5 vlakken (met een verticale resolutie van 10 μm) voor de meeste doeleinden. Gebruik voor de lever 3 of minder vliegtuigen. Stel de laserversterking in. Dit moet empirisch worden getest voor verschillende weefsels en scandiepten. Definieer het mappad en de naam voor het opslaan van de verkregen afbeeldingen en verstrek de juiste informatie voor het metabestand van de afbeelding. Controleer alle ingevoerde waarden nogmaals. Klik op de 3D-mozaïekinstelling om het scanproces te starten (Figuur 1D). Nadat de beeldvorming is voltooid, verzamelt u de weefselsecties voorzichtig uit het waterreservoir en bewaart u ze in de opslagbuffer bij -20 °C tot verder gebruik (Figuur 1E; Figuur 2C,D). 7. Beeldverwerking en data-analyse Download de MATLAB-scripts op een Linux-computer van https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020. Kopieer de scripts naar een map, bijvoorbeeld /home/user/Program/.OPMERKING: De Computer Vision Toolbox-add-on voor MATLAB en Fiji (of ImageJ) moet op Linux-computers worden geïnstalleerd om het script volledig te laten functioneren. Naai tegelafbeeldingen zoals hieronder beschreven.Gegevens overbrengen van de tomograafserver naar de Linux-computer. Open het MATLAB-script StepOneStitchingAndArchive.m en zoek de bronmap met de onbewerkte gegevens. Definieer de bron- en doelmappen in het script. Ga naar het tabblad Editor en klik op Uitvoeren. Voortgangsinformatie wordt weergegeven in het opdrachtvenster. De verwerking omvat het lezen van informatie uit het Mosaic-bestand, het genereren van een tegelindex voordat de afbeelding wordt samengevoegd, correctie van de achtergrondverlichting met Cidre22 (Figuur 3) en verlichtingscorrectie tussen optische lagen die op verschillende dieptes zijn verkregen. Zoek de samengevoegde afbeeldingen in een submap met de naam stitchedImages_100 in de bronmap. Comprimeer de onbewerkte gegevens voor langdurige opslag met behulp van de tar-opdracht en sla ze op als een enkel bestand met de bestandsnaamextensie tar.bz2 (Figuur 1F). Voer modeltraining en segmentatie uit met een ondersteunende vectormachine. Volg de onderstaande stappen om de ondersteuningsvectormachine te trainen en de segmentatie uit te voeren.OPMERKING: De samengevoegde afbeeldingen voor elk van de drie fluorescentiekanalen worden opgeslagen in 3 submappen (genaamd 1, 2 en 3, overeenkomend met rode, oranje en groene fluorescentie) van stitchedImages_100. Elke submap bevat alle samengevoegde afbeeldingen van hetzelfde kanaal.Bekijk een voorbeeld van de gestikte afbeeldingen. Open één afbeelding met dezelfde bestandsnaam uit elke submap met Fiji (of ImageJ). Voeg de drie kanalen samen tot één kleurenafbeelding. Pas de helderheid van elk kanaal aan totdat er duidelijke signalen te zien zijn van autofluorescentie van bacteriën en weefsel. Noteer het aangepaste maximale intensiteitsniveau van elk kanaal voor de volgende stap. Open het MATLAB-script StepTwoSegmentationAndAnalysis.m en blader naar de bron. Definieer de bronmap en de afbeeldingsnamen voor de training. BijvoorbeeldsourceD = ‘/’ ;red_name = [bronD ‘1/section_020_01.tif’]; green_name = [bronD ‘2/section_020_01.tif’];blue_name = [bronD ‘3/section_020_01.tif’]; Ga naar het tabblad Editor en klik op Uitvoeren. Er verschijnt een dialoogvenster waarin om kleurdrempels wordt gevraagd, vul het op basis van eerdere handmatige controle met Fiji (stap 7.3.1). Selecteer regio’s voor achtergrond en interessante regio’s (d.w.z. bacteriën) volgens de dialoogvensters. Er verschijnen grafieken die laten zien hoe goed het model is getraind en met de vraag of er meer regio’s moeten worden toegevoegd. Voeg meer interessegebieden en achtergrondgebieden toe totdat de bacteriën duidelijk kunnen worden gesegmenteerd (Figuur 4A,B). Geef het model een naam en sla het op. Het script laadt automatisch de afbeeldingen en past een mediaanfilter toe (straal 2 pixels). Het segmentatieproces wordt automatisch uitgevoerd en voortgangsinformatie wordt weergegeven in het opdrachtvenster. Bekijk de voortgang van de segmentatie. Als de segmentatie niet goed werkt met het model op andere gestikte afbeeldingen, herhaalt u de modeltraining om meer achtergrond- en bacteriële gebieden op te nemen. Als u de resultaten van de segmentatie wilt zien, controleert u het bestand met de naam Allpositions_filter3D.txt. Dit bestand bevat de coördinaten van het zwaartepunt voor elke bacterie of bacteriële microkolonie en de bijbehorende geïntegreerde fluorescentie-intensiteit (Figuur 1G). Verwijder extra artefacten met een convolutioneel neuraal netwerk zoals hieronder beschreven.OPMERKING: Voor sommige bacteriën bevat eenvoudige segmentatie met de Support Vector Machine nog steeds enkele beeldvormingsartefacten. Dit geldt met name voor bacteriën die YPet tot expressie brengen. Segmentatie op basis van neurale netwerken kan deze artefacten efficiënt verwijderen (Figuur 4C). De Computer Vision Toolbox-add-on voor MATLAB en Fiji (of ImageJ) moet op Windows-computers worden geïnstalleerd om het script volledig te laten functioneren. Voor informatie over het onderliggende neurale netwerk zie: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.htmlBereid de afbeeldingen voor. Converteer tif-bestanden naar jpg-bestanden met verschillende helderheidsaanpassingen met behulp van Fiji. Identificeer met handmatige curatie ten minste 600 bacteriën en 600 artefacten en veilige bijgesneden afbeeldingen van deze objecten in de juiste mappen. Open het MATLAB-script CNNtestV4.m en blader naar de bronbestanden met de objectafbeeldingen van stap 7.4.1. Definieer de afbeeldingsmap voor training. BijvoorbeelddigitDatasetPath = fullfile (‘D:\20200602_CNN’,’fortrainingPixel12Folder2′);Definieer het aantal afbeeldingen voor training, bijv. numTrainFiles = 600. Ga naar het tabblad Editor en klik op Uitvoeren. Na de training wordt het CNN-modelbestand opgeslagen als gregnet1.mat in de bronmap. Definieer een map met testafbeeldingen. BijvoorbeelddigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).De resultaten worden opgeslagen in een bestand YourFile.txt dat informatie bevat over de naam van de afbeelding en de classificatie als bacterie of artefact. Definieer de map met testafbeeldingen. BijvoorbeelddigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).De resultaten worden opgeslagen in een bestand YourFile.txt, dat informatie bevat over de naam van de afbeelding en de classificatie als bacterie of artefact. Schat de grootte van microkolonies op basis van de fluorescentie-intensiteit van afzonderlijke bacteriën, zoals hieronder beschreven.OPMERKING: De ruimtelijke resolutie van de tomograaf is onvoldoende om individuele bacteriële cellen in dicht opeengepakte microkolonies op te lossen. Het aantal bacteriën in elke microkolonie kan echter worden geschat op basis van de totale fluorescentie van de microkolonie in relatie tot de fluorescentie van afzonderlijke bacteriën. De nauwkeurigheid van deze schatting hangt af van de homogeniteit van de fluorescentie-intensiteit in de bacteriepopulatie.Bevestig de identiteit van GFP-positieve gebeurtenissen in de STP-tomografie door bacteriële componenten zoals lipopolysaccharide te kleuren met behulp van immunohistochemie van opgehaalde secties van de tomograaf (Figuur 1H; Figuur 5). Identificeer ten minste 30 afzonderlijke bacteriën en haal hun fluorescentie-intensiteit uit de overeenkomstige segmentatieresultaten. Gebruik de mediane intensiteitswaarde als referentie voor een enkele bacterie. Bereken het aantal bacteriën van elke microkolonie door de totale fluorescentie-intensiteit van de microkolonie te delen door de referentiewaarde voor een enkele bacterie (Figuur 1I). Voer een 3D-reconstructie uit met visualisatiesoftware zoals hieronder beschreven.Voorbereiding van de afbeeldingNeem de beelden van het blauwe kanaal, die tweede harmonische signalen van collageen bevatten die een nuttige anatomische referentie vormen, waaronder weefselcapsules, slagaders en trabeculae. Gebruik afbeeldingen die zijn gesegmenteerd voor bacteriën als het2e kanaal. Zet de afbeeldingen van het 1ekanaal 10-voudig op in zowel de x- als de y-as en sla de verkleinde afbeeldingen op in een nieuwe map. Maak 3 replica’s van verkleinde afbeeldingen in dezelfde map. De naam van nieuwe replicaten moet dezelfde volgorde behouden. Bijvoorbeeld: section_001_01.tif, repliceer 1 met naam section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Pas deze stappen ook toe op de afbeeldingen van het2e kanaal. De inkrimping levert beter beheersbare bestandsgroottes op. De drievoudige afbeeldingen zullen de z-as vloeiender maken. Voeg de afbeeldingen van elk kanaal samen om afbeeldingsstapels te vormen met Fiji. Klik op Afbeelding > Stapels > Hulpmiddelen > Stapelsorteerder > Sorteren op labels. Voer 3D-filtering uit. Klik op Verwerken > filters > 3D-filter en stel de Z-filtergrootte in op 6. Sla de afbeeldingsstapels op. Voer 3D-visualisatie uit zoals hieronder beschreven.Open het visualisatiesoftwarepakket in de Arena-weergave (standaardinstelling). Gebruik het pictogram Horlogemap om mappen toe te voegen aan de Arena-weergave. Dubbelklik om het bestand *.ims of *.tif te openen (voorbereid in 7.6.1). Gebruik Edit>Image Properties om de kleurrepresentaties (LUT’s) van de verschillende kanalen in het venster Display Adjustment aan te passen. Klik op Geavanceerd om handmatig de min/max-waarden en een waarde voor gammacorrectie in te stellen.Klik op de kanaalnamen om de namen en LUT’s te wijzigen. Nadat u het uiterlijk van de afbeelding hebt aangepast, exporteert u de huidige weergave met behulp van de Snapshot-tool. Gebruik het pictogram Animatie om de 3D-gegevens weer te geven als een film. Gebruik de navigatieaanwijzer om een perspectief/weergave te vinden en in te zoomen en gebruik + Toevoegen om hoofdframes toe te voegen. Ga naar een andere positie en voeg het volgende hoofdframe toe. Druk op de rode opnameknop om de film te maken. Sla het op in de gewenste bestemmingsmap en het gewenste bestandstype (Figuur 1J).