Tomografia tridimensionale tridimensionale ad alta risoluzione di infezioni microbiche

Tutti gli esperimenti sugli animali qui descritti sono stati approvati dalle autorità (licenza 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) e seguono le linee guida locali (Tierschutz-Verordnung, Basilea) e la legge svizzera sulla protezione degli animali (Tierschutz-Gesetz). 1. Preparazione e conservazione dei tessuti infetti Utilizzare un modello di infezione a scelta. Qui, topi di età compresa tra 10 e 16 settimane di entrambi i sessi vengono infettati con ~ 1.000 unità formanti colonie (CFU) mediante iniezione endovenosa o 5 x 107 CFU mediante somministrazione intragastrica con un ago a punta tonda. I ceppi di topi adatti includono BALB/c e C57BL/6.NOTA: Lo stesso approccio può essere facilmente adattato per altre specie ospiti. Assicurarsi che i patogeni esprimano proteine fluorescenti per consentire l’identificazione nei tessuti non colorati. I patogeni che esprimono GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 o mWasabi16 possono essere visualizzati utilizzando l’eccitazione a 940 nm17. La Salmonella che esprime mCherry18 a livelli facilmente rilevabili mediante citometria a flusso19 potrebbe essere visualizzata utilizzando un’eccitazione di 800 nm, ma ha scarsi rapporti segnale/fondo nella milza e nel fegato infetti, che mostrano una sostanziale autofluorescenza. Assicurarsi che tutte le proteine fluorescenti mantengano >70% della loro intensità di fluorescenza dopo la fissazione con paraformaldeide a pH neutro sulla base della quantificazione con citometria a flusso. Qui vengono utilizzati tessuti di topo infetti, vale a dire milza, fegato, linfonodi e cerotti di Peyer. Colorare i marcatori della superficie delle cellule ospiti in vivo iniettando anticorpi marcati con ficoeritrina (PE) 10 minuti prima della perfusione. Per colorare i neutrofili, iniettare per via endovenosa 4 μg di anti-Ly-6G-PE in 100 μL di PBS. Per colorare i macrofagi della zona marginale nella milza, iniettare 4 μg di anti-CD169-PE in 100 μL di PBS (vedi Tabella dei materiali). Fissare i tessuti infetti attraverso la perfusione transcardica standard20 con 15 mL di tampone fosfato 50 mM ghiacciato (PB; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7,4), seguito da 35 mL di paraformaldeide al 4% (PFA; fissativo) in PB (Figura 1A).In breve, somministrare l’anestesia profonda all’animale infetto mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di ketamina e 16 mg/kg di xilazina. Garantire un’adeguata anestesia confermando la perdita del riflesso di pizzicamento delle dita. Disinfetta il pelo usando etanolo al 70%, asciugalo con un tovagliolo di carta sterile e apri chirurgicamente il torace con una pinzetta e delle forbici. Posizionare un ago sterile nel ventricolo sinistro del cuore, aprire l’atrio destro con forbici sterili e far scorrere il primo tampone e poi il fissativo attraverso l’ago, il ventricolo sinistro e l’intero sistema vascolare utilizzando una pompa. Questo fissa tutti i tessuti in modo rapido e uniforme e provoca l’eutanasia. Raccogliere il tessuto dopo la perfusione, incubarlo in un volume 20x di paraformaldeide fredda al 4% in tampone PB e posizionarlo su un agitatore a 4 °C per una notte (Figura 1B). L’imaging è possibile per tessuti di dimensioni comprese tra 0,05 e 2 cm3. Per fazzoletti più grandi, tagliare in pezzi adatti. Il giorno successivo, lavare il fazzoletto 3 volte per 10 minuti ciascuno con tampone PB agitando a 40 giri/min a temperatura ambiente per rimuovere il PFA.NOTA: A causa della tossicità del PFA, questi passaggi devono essere eseguiti all’interno di una cappa aspirante. Smaltire i rifiuti di PFA secondo le linee guida istituzionali. Rimuovere il tampone PB in eccesso e aggiungere 20 volte il volume del tampone di conservazione crioprotettore21 (876 mM di saccarosio, 0,25 mM di polivinilpirrolidone, 40% (v/v) di glicole etilenico, disciolto in 50 mM di tampone PB) al campione agitando a 40 giri/min a 4 °C per 6-8 ore o fino a quando i tessuti non affondano sul fondo. Incubare i campioni a -20 °C per almeno 3 giorni per garantire un’efficace riduzione dell’autofluorescenza tissutale11. I campioni possono essere utilizzati fino a 5 anni se conservati a -20 °C.NOTA: L’affondamento del tessuto indica una corretta penetrazione del tampone di conservazione nel tessuto. 2. Inclusione del campione Incorporare il tessuto in un blocco di agarosio per un taglio regolare con un vibratomo. Pre-attivare chimicamente l’agarosio mediante ossidazione con periodato e quindi ridurre con boroidruro per formare un legame incrociato con il tessuto per una migliore stabilità durante il processo di taglio. Eseguire i passaggi descritti di seguito. Preparare l’agarosio ossidato al 4% pesando 2,25 g di agarosio e aggiungere 0,21 g di NaIO4. Aggiungere 100 ml di PB all’agarosio e NaIO4. Agitare a temperatura ambiente in cappa aspirante per 2-3 h al riparo dalla luce.NOTA: Passaggio critico: non superare l’agitazione per più di 3 ore o l’agarosio polimerizzerà male. Recuperare l’agarosio mediante filtrazione a membrana in un filtro sottovuoto standard con membrana da 0,2 μm. Rimuovere il NaIO4 rimanente lavando 3 volte con 50 ml di tampone PB. Risospendere l’agarosio ossidato in 50 mL di tampone PB.NOTA: Non sciogliere l’agarosio durante questa fase. L’agarosio può essere conservato a 4 °C per un massimo di 2-3 settimane al riparo dalla luce. Preparare la soluzione di boroidruro aggiungendo 19 g di borace e 3 g di acido borico a 1 L di acqua. Mescolare fino a quando non si sarà sciolto e regolare il pH a 9-9,5 con 1 M NaOH. Su una piastra di agitazione in una cappa aspirante, riscaldare 100 mL di tampone borato a 40 °C. Aggiungere 0,2 g di NaBH4 e mescolare per 15-30 minuti proteggendo dalla luce.NOTA: La soluzione di boroidruro può essere conservata per diverse settimane a temperatura ambiente al buio. Passaggio critico: quando si aggiunge NaBH4 al tampone di borato, si formerà del gas, quindi eseguire questo passaggio all’interno di una cappa aspirante. Non eseguire questa operazione in un contenitore ermeticamente sigillato perché potrebbe causare un’esplosione. Prelevare il tessuto dal congelatore dopo un’incubazione sufficiente per ridurre l’autofluorescenza (≥ 3 giorni), rimuovere il tampone di conservazione del crioprotettore in eccesso e lavare il tessuto 3 volte per 10 minuti ciascuno con tampone PB agitando a 40 giri/min a temperatura ambiente (RT). Sciogliere circa 20 mL di sospensione di agarosio ossidato (preparata al punto 1) in un forno a microonde (700 W per ~30 s), lasciarla raffreddare abbastanza da poter essere maneggiata (~45 °C) e versarla in uno stampo di plastica.NOTA: Passaggio critico: non aggiungere l’agarosio subito dopo averlo riscaldato nel microonde sul campione, ciò potrebbe portare alla distruzione del tessuto. Usa una pinzetta per raccogliere delicatamente il fazzoletto e inserirlo rapidamente nella parte inferiore centrale dell’agarosio. Incubare lo stampo a RT per 15 minuti per consentire all’agarosio di polimerizzare. Dopo la polimerizzazione dell’agarosio, aprire lo stampo di plastica con un bisturi dai quattro angoli e raccogliere con cura il cubo di agarosio con le dita guantate. Immergere il campione in una soluzione di boroidruro (preparata nella fase 2) per 2-3 ore a 4 °C per avviare la reticolazione dell’agarosio ossidato e del tessuto. Ciò impedisce al tessuto di staccarsi durante il sezionamento.NOTA: Passaggio critico: il campione immerso nel boroidruro deve essere incubato al riparo dalla luce a 4 °C. Lavare il cubetto di agarosio con tampone PB 2 volte per 10 minuti. Girare il cubo di agarosio in modo che il tessuto si trovi nella parte superiore e attaccare il blocco a un vetrino magnetico (vetrino da microscopio con due magneti attaccati sul retro) utilizzando alcune gocce di adesivo istantaneo. La colla impiega 10-20 minuti per solidificarsi, quindi posizionare un fazzoletto di carta con gocce di tampone PB sopra l’agarosio assicurandosi che il campione rimanga adeguatamente idratato per tutto il tempo (Figura 1C). 3. Preparazione del microtomo e preparazione del terreno Posizionare la slitta magnetica sul metallo al centro della scatola del campione del tomografo. Riempire la scatola con tampone PB e posizionarla con cura sul tavolino e serrare la vite a sinistra per fissare la scatola del campione sul tavolino del tomografo.NOTA: Non serrare eccessivamente le viti, altrimenti si danneggerà la scatola di plastica. Posizionare la lama sul microtomo e spostare con cautela la posizione del campione vicino e sotto il microtomo. La superficie superiore dell’agarosio deve essere allo stesso livello della lama del microtomo.NOTA: Posizionarlo troppo in basso farà perdere tempo di taglio, mentre posizionarlo troppo in alto rimuoverà una grossa fetta del blocco al primo taglio. Sposta il tavolino per posizionare il cubo di agarosio al centro dell’obiettivo e fai clic ripetutamente sul pulsante Affetta nel software del tomografo fino a ottenere una fetta intatta dell’intero cubo di agarosio. 4. Assegnazione della superficie e acquisizione di immagini 2D Centrare la lente dell’obiettivo sul campione di tessuto nelle direzioni x e y. Aprire il software del laser e accendere il laser nel software. Quando si sente un ticchettio, accendere l’interruttore laser e regolare la lunghezza d’onda a 800 nm.NOTA: La sorgente laser deve essere riscaldata per almeno 30 minuti, idealmente 1 ora, prima dell’imaging. Chiudere le porte dell’armadio del microscopio, spegnere tutte le fonti di luce nella stanza, accendere i PMT e impostare la tensione a 750 V.NOTA: Passaggio critico: i PMT sono molto sensibili alla luce, tenerla spenta a meno che le ante dell’armadio non siano chiuse e tutte le fonti di luce nella stanza siano spente. Regolare le impostazioni del protocollo del software del tomografo come descritto e impostare l’otturatore del microscopio su automatico e la tensione su 20 e 3 rispettivamente per V1 e V2. Fare clic sul pulsante 2D nel software del tomografo per acquisire uno scatto del campione. Una volta visualizzata un’immagine con autofluorescenza visibile, regolare il piezo z per impostare il piano focale sulla superficie del cubo di agarosio. La prima scansione sarà a 20 μm sotto la superficie per acquisire un’immagine stabile del campione.Se non è visibile alcuno sfondo di autofluorescenza, aumentare il contrasto fino a quando non viene visualizzato un segnale. Può accadere che non ci sia alcun segnale visibile (ad esempio, a causa dell’agarosio sulla parte superiore del tessuto). In questo caso, regolare l’asse z utilizzando il dispositivo piezoelettrico z fino a raggiungere la superficie dell’agarosio. Potrebbe essere necessario un movimento manuale dell’obiettivo se la posizione desiderata è al di fuori della portata del dispositivo piezoelettrico z. Taglia più fette da 50 μm dopo aver trovato la superficie del campione e acquisisci immagini 2D dopo ogni taglio per assicurarti che il piano focale sia impostato correttamente sulla superficie del blocco. 5. Trovare i bordi dei campioni e impostare il laser al punto di partenza Sulla base delle coordinate xy dell’area di scansione laser (4 coordinate angolari), confinare l’area di imaging al tessuto con un’imaging minima del blocco di agarosio circostante. Spegnere i PMT, impostare la lunghezza d’onda del laser su 800 nm, aprire l’otturatore laser. La posizione della luce laser che entra nel blocco di agarosio è visibile come una macchia rossa di luce diffusa (Figura 2A, B).Passaggio critico: prestare particolare attenzione con il laser di classe 4. Può danneggiare rapidamente i tessuti umani e gli occhi. Il personale ha bisogno di una formazione speciale per utilizzare uno strumento di questo tipo in modo sicuro. Usa lo spot laser mentre sposti il tavolino per trovare le coordinate dei bordi del tessuto utilizzando la sequenza indietro, destra, davanti e sinistra. Ricontrolla le coordinate e posiziona lo spot laser nell’angolo anteriore destro, che è il punto di partenza predefinito per l’imaging del tessuto. Converti le coordinate dalla finestra della console in dimensioni di blocco riconoscibili dal computer, definite dai passaggi xy. Inserire queste misurazioni dei passi nel protocollo del software. Chiudere le ante dell’armadio. 6. 3D di scansione / sezionamento Modificare la lunghezza d’onda a 940 nm per eccitare GFP, mWasabi o YPet e PE.NOTA: Il laser è invisibile all’occhio umano a questa lunghezza d’onda. Per migliorare il segnale-sfondo per GFP, mWasabi e il componente di emissione verde di TIMERbac, posizionare un filtro passa-banda stretto 510/20 nm davanti a PMT 2. Ciò riduce l’interferenza dell’autofluorescenza tissutale verde-gialla. Impostare l’otturatore del microscopio in modalità automatica e le impostazioni della tensione dell’otturatore su 20 per V1 e 1,71 per V2. Regolare i seguenti tre parametri nel software: Spessore della sezione- per la maggior parte degli scopi, impostato su 50 μm. Per il fegato, impostare a 30 μm a causa della limitata profondità di imaging. Il numero di sezioni fisiche: determina la profondità totale del tessuto che verrà visualizzata, impostata di conseguenza. Il numero di aerei da catturare per ogni sezione: questo determinerà la risoluzione z. Utilizzare 5 piani (con una risoluzione verticale di 10 μm) per la maggior parte degli scopi. Per il fegato utilizzare 3 o meno aerei. Imposta il guadagno del laser. Questo deve essere testato empiricamente per diversi tessuti e profondità di scansione. Definire il percorso e il nome della cartella per la memorizzazione delle immagini acquisite e fornire le informazioni appropriate per il metafile di imaging. Ricontrolla tutti i valori inseriti. Fare clic sull’impostazione mosaico 3D per avviare il processo di scansione (Figura 1D). Al termine dell’imaging, raccogliere con cura le sezioni di tessuto dal serbatoio dell’acqua e conservarle in un tampone di conservazione a -20 °C fino a nuovo utilizzo (Figura 1E; Figura 2C, D). 7. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati Scarica gli script MATLAB su un computer Linux da https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020. Copia gli script in una cartella, ad esempio /home/user/Program/.NOTA: Il componente aggiuntivo Computer Vision Toolbox per MATLAB e Fiji (o ImageJ) deve essere installato su computer Linux affinché lo script sia completamente funzionante. Unisci le immagini delle tessere come descritto di seguito.Trasferisci i dati dal server del tomografo al computer Linux. Apri lo script MATLAB StepOneStitchingAndArchive.m e individua la cartella di origine contenente i dati grezzi. Definire le cartelle di origine e di destinazione nello script. Passa alla scheda Editor e fai clic su Esegui. Le informazioni sullo stato di avanzamento vengono visualizzate nella finestra di comando. L’elaborazione include la lettura delle informazioni dal file Mosaic, la generazione dell’indice delle tessere prima dello stitching dell’immagine, la correzione dell’illuminazione di sfondo con Cidre22 (Figura 3) e la correzione dell’illuminazione tra strati ottici acquisiti a diverse profondità. Trova le immagini unite in una sottocartella chiamata stitchedImages_100 nella cartella di origine. Comprimere i dati grezzi per l’archiviazione a lungo termine utilizzando il comando tar e salvarli come file singolo con l’estensione tar.bz2 (Figura 1F). Esegui l’addestramento e la segmentazione del modello con la macchina vettoriale di supporto. Per addestrare la macchina a vettori di supporto ed eseguire la segmentazione, attenersi alla seguente procedura.NOTA: Le immagini unite per ciascuno dei tre canali di fluorescenza sono memorizzate in 3 sottocartelle (denominate 1, 2 e 3, corrispondenti alla fluorescenza rossa, arancione e verde) di stitchedImages_100. Ogni sottocartella contiene tutte le immagini unite dallo stesso canale.Visualizza l’anteprima delle immagini cucite. Apri un’immagine con lo stesso nome file da ogni sottocartella con Fiji (o ImageJ). Unisci i tre canali in un’unica immagine a colori. Regolare la luminosità di ciascun canale fino a quando non si vedono segnali chiari dai batteri e dall’autofluorescenza dei tessuti. Annotare il livello di intensità massimo regolato di ciascun canale per il passaggio successivo. Apri lo script MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m e vai alla fonte. Definire la cartella di origine e i nomi delle immagini per il training. Per esempiosourceD = ‘/’ ;red_name = [sourceD ‘1/section_020_01.tif’]; green_name = [sourceD ‘2/section_020_01.tif’];blue_name = [sourceD ‘3/section_020_01.tif’]; Vai alla scheda Editor e fai clic su Esegui. Apparirà una finestra di dialogo che richiede le soglie di colore, riempila in base al precedente controllo manuale con Fiji (passaggio 7.3.1). Seleziona le regioni per lo sfondo e le regioni di interesse (ad esempio, i batteri) in base alle finestre di dialogo. Verranno visualizzati grafici che mostrano il livello di training del modello e chiedono se è necessario aggiungere altre aree. Aggiungere altre regioni di interesse e di sfondo fino a quando i batteri possono essere chiaramente segmentati (Figura 4A, B). Assegna un nome al modello e salvalo. Lo script caricherà automaticamente le immagini e applicherà un filtro mediano (raggio 2 pixel). Il processo di segmentazione viene eseguito automaticamente e le informazioni sullo stato di avanzamento vengono visualizzate nella finestra di comando. Guarda l’andamento della segmentazione. Se la segmentazione non funziona bene con il modello su altre immagini unite, ripeti l’addestramento del modello per includere più regioni di sfondo e batteriche. Per vedere i risultati della segmentazione, controlla il file denominato Allpositions_filter3D.txt. Questo file contiene le coordinate del baricentro per ogni batterio o microcolonia batterica e la corrispondente intensità di fluorescenza integrata (Figura 1G). Rimuovere ulteriori artefatti con la rete neurale convoluzionale come descritto di seguito.NOTA: Per alcuni batteri, la semplice segmentazione con la Support Vector Machine include ancora alcuni artefatti di imaging. Ciò è particolarmente vero per i batteri che esprimono YPet. La segmentazione basata su reti neurali può rimuovere in modo efficiente questi artefatti (Figura 4C). L’add-on Computer Vision Toolbox per MATLAB e Fiji (o ImageJ) deve essere installato su computer Windows affinché lo script sia completamente funzionante. Per informazioni sulla rete neurale sottostante vedere: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.htmlPrepara le immagini. Converti i file tif in file jpg con diverse regolazioni della luminosità utilizzando le Fiji. Identifica con la cura manuale almeno 600 batteri e 600 artefatti e salva le immagini ritagliate di questi oggetti in cartelle appropriate. Aprire lo script MATLAB CNNtestV4.m e individuare i file di origine contenenti le immagini degli oggetti del passaggio 7.4.1. Definire la cartella di immagini per il training. Per esempiodigitDatasetPath = fullfile (‘D:\20200602_CNN’,’fortrainingPixel12Folder2′);Definisci il numero di immagini per l’addestramento, ad esempio numTrainFiles = 600. Vai alla scheda Editor e fai clic su Esegui. Dopo l’addestramento, il file del modello CNN viene salvato come gregnet1.mat nella cartella di origine. Definire una cartella con le immagini di prova. Per esempiodigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).I risultati vengono salvati in un file YourFile.txt che contiene informazioni sul nome dell’immagine e sulla classificazione come batterio o artefatto. Definisci la cartella con le immagini di prova. Per esempiodigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).I risultati verranno salvati in un file YourFile.txt, che contiene informazioni sul nome dell’immagine e sulla classificazione come batteri o artefatti. Stimare la dimensione delle microcolonie in base all’intensità di fluorescenza dei singoli batteri come descritto di seguito.NOTA: La risoluzione spaziale del tomografo è insufficiente per risolvere le singole cellule batteriche all’interno di microcolonie densamente impacchettate. Tuttavia, il numero di batteri in ciascuna microcolonia può essere stimato in base alla fluorescenza totale della microcolonia in relazione alla fluorescenza dei singoli batteri. L’accuratezza di questa stima dipende dall’omogeneità dell’intensità della fluorescenza nella popolazione batterica.Confermare l’identità degli eventi GFP-positivi nella tomografia STP colorando i componenti batterici come il lipopolisaccaride utilizzando l’immunoistochimica delle sezioni recuperate dal tomografo (Figura 1H; Figura 5). Identificare almeno 30 singoli batteri e recuperare la loro intensità di fluorescenza dai risultati della segmentazione corrispondenti. Utilizzare il valore di intensità mediana come riferimento per un singolo batterio. Calcolare il numero batterico di ciascuna microcolonia dividendo l’intensità totale di fluorescenza della microcolonia per il valore di riferimento per un singolo batterio (Figura 1I). Esegui la ricostruzione 3D con il software di visualizzazione come descritto di seguito.Preparazione dell’immaginePrendiamo le immagini del canale blu, che contengono segnali di seconda armonica del collagene fornendo un utile riferimento anatomico tra cui capsule tissutali, arterie e trabecole. Utilizzare immagini segmentate per i batteri come 2° canale. Raccogli le immagini dal 1° canale di 10 volte su entrambi gli assi x e y e salva le immagini ridimensionate in una nuova cartella. Crea 3 repliche di immagini ridimensionate all’interno della stessa cartella. Il nome delle nuove repliche deve mantenere la stessa sequenza. Ad esempio: section_001_01.tif, replica 1 con nome section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Applicare questi passaggi anche alle immagini dal 2° canale. Il ridimensionamento produce file di dimensioni più gestibili. Le immagini triple smusseranno l’asse z. Unisci le immagini di ciascun canale per formare pile di immagini con le Fiji. Fare clic su Immagine > Pile > Strumenti > Ordinatore pile > Ordina per etichette. Eseguire il filtraggio 3D. Fare clic su Elabora filtri > > filtro 3D e impostare la dimensione del filtro Z su 6. Salva le pile di immagini. Eseguire la visualizzazione 3D come descritto di seguito.Aprire il pacchetto software di visualizzazione nella vista Arena (impostazione predefinita). Usa l’icona Cartella di controllo per aggiungere cartelle alla vista Arena. Fare doppio clic per aprire il file *.ims o *.tif (preparato nella versione 7.6.1). Utilizzando le proprietà Modifica>Immagine, regolare le rappresentazioni dei colori (LUT) dei diversi canali nella finestra Regolazione visualizzazione. Fare clic su Avanzate per impostare manualmente i valori min/max e un valore per la correzione gamma.Fare clic sui nomi dei canali per modificare i nomi e le LUT. Dopo aver regolato l’aspetto dell’immagine, esportate la vista corrente utilizzando lo strumento Istantanea. Utilizzare l’icona Animazione per rappresentare i dati 3D come un filmato. Usa il puntatore di navigazione per trovare una prospettiva/vista e ingrandisci e usa + Aggiungi per aggiungere fotogrammi chiave. Spostati in un’altra posizione e aggiungi il fotogramma chiave successivo. Premi il pulsante rosso di registrazione per creare il filmato. Salvarlo nella cartella di destinazione e nel tipo di file desiderati (Figura 1J).