微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

ここに記載されているすべての動物実験は、当局によって承認されており(ライセンス2239、Kantonales Veterinäramt Basel)、現地のガイドライン(Tierschutz-Verordnung、バーゼル)およびスイスの動物保護法(Tierschutz-Gesetz)に従っています。 1. 感染組織の調製と保管 選択した感染モデルを使用します。ここでは、雌雄ともに10〜16週齢のマウスに、静脈内注射により~1,000コロニー形成単位(CFU)を、丸い針による胃内投与により5×107CFU を感染させます。適切なマウス系統には、BALB/cおよびC57BL/6が含まれます。注:同じアプローチは、他の宿主種にも簡単に適応できます。 病原体が蛍光タンパク質を発現し、未染色組織での同定を可能にすることを確認します。GFP.mut213、YPet14、TIMERbac15、またはmWasabi16を発現する病原体は、全て940nmの励起17を用いて可視化することができる。フローサイトメトリー19で容易に検出できるレベルでmCherry18を発現するサルモネラ菌は、800 nmの励起を使用してイメージングできますが、感染した脾臓と肝臓ではS/S/Backgroundの比率が低く、かなりの自家蛍光を示します。 フローサイトメトリーによる定量に基づいて、パラホルムアルデヒドを中性pHで固定した後、すべての蛍光タンパク質が蛍光強度の>70%を保持することを確認します。ここでは、感染したマウス組織、すなわち脾臓、肝臓、リンパ節、およびパイエル板が使用されます。 灌流の10分前にフィコエリトリン(PE)標識抗体を注入することにより、 in vivo で宿主細胞表面マーカーを染色します。好中球を染色するには、100 μL の PBS に 4 μg の抗 Ly-6G-PE を静脈内注入します。脾臓の辺縁領域マクロファージを染色するには、100 μL の PBS に 4 μg の抗 CD169-PE を注入します ( 材料の表を参照)。 15 mLの氷冷50 mMリン酸緩衝液(PB;10 mM NaH2PO4、40 mMNa2HPO4、pH 7.4)で標準的な心血管灌流20で感染組織を固定し、続いてPBに35 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA;固定剤)をPBで固定します(図1A)。簡単に言えば、100 mg / kgケタミンと16 mg / kgキシラジンの腹腔内注射により、感染した動物に深部麻酔を投与します。つま先つま先挟み反射の喪失を確認することにより、適切な麻酔を確保します。 70%エタノールを使用して毛皮を消毒し、滅菌ペーパータオルで乾かし、ピンセットとはさみで胸を外科的に開きます。心臓の左心室に滅菌針を留置し、滅菌ハサミで右心房を開き、ポンプを使用して最初のバッファーと固定剤を針、左心室、および血管系全体に流します。これにより、すべての組織が迅速かつ均一に固定され、安楽死を引き起こします。 灌流後に組織を採取し、PBバッファー中の20倍容量の4%冷パラホルムアルデヒドでインキュベートし、4°Cのシェーカーに一晩置きます(図1B)。0.05〜2cm3のサイズ範囲の組織に対してイメージングが可能です。大きな組織の場合は、適切な部分にカットします。 翌日、ティッシュをPBバッファーでそれぞれ10分間3回洗浄し、室温で40rpmで振とうしてPFAを除去します。注:PFAの毒性のため、これらの手順はドラフト内で実行する必要があります。PFA廃棄物は、機関のガイドラインに従って処分してください。 余分なPBバッファーを取り除き、20倍の量の凍結保護剤保存バッファー21 (876 mMスクロース、0.25 mMポリビニルピロリドン、40%(v / v)エチレングリコール、50 mM PBバッファーに溶解)をサンプルに加え、4°Cで40 rpmで6〜8時間、または組織が底に沈むまで振とうします。サンプルを-20°Cで少なくとも3日間インキュベートして、組織の自家蛍光を効果的に減少させます11。サンプルは、-20°Cで保存した場合、最大5年間使用できます。注:組織の沈下は、保存バッファーが組織に適切に浸透していることを示しています。 2. サンプルの埋め込み 組織をアガロースブロックに埋め込むと、ビブラトームでスムーズに切断できます。アガロースを過ヨウ素酸で酸化して化学的に活性化し、次に水素化ホウ素で還元して組織との架橋を形成し、切断プロセス中の安定性を向上させます。以下で説明する手順を実行します。 2.25 gのアガロースを秤量して4%酸化アガロースを調製し、0.21 gのNaIO4を加えます。100 mLのPBをアガロースとNaIO4に加えます。ヒュームフード内で室温で2〜3時間攪拌し、光から保護します。注:重要なステップ:3時間以上攪拌しないと、アガロースの重合が不十分になります。 アガロースを0.2 μmのメンブレンを備えた標準的な真空フィルターでメンブレンろ過により回収します。残りのNaIO4 を50 mLのPBバッファーで3回洗浄して除去します。酸化したアガロースを50 mLのPBバッファーに再懸濁します。注意: この段階ではアガロースを溶かさないでください。アガロースは、光から保護されて、最大2〜3週間4°Cで保存できます。 19gのホウ砂と3gのホウ酸を1Lの水に加えて、水素化ホウ素溶液を調製します。溶解するまで撹拌し、1 M NaOHでpHを9〜9.5に調整します。ドラフト内の攪拌プレートで、100 mLのホウ酸緩衝液を40°Cに加熱します。 0.2 gのNaBH4 を加え、光から保護しながら15〜30分間攪拌します。注:水素化ホウ素溶液は、暗所で室温で数週間保存できます。重要なステップ:ホウ酸バッファーにNaBH4 を添加すると、ガスが形成されるため、このステップはヒュームフード内で行ってください。この手順は、爆発につながる可能性があるため、密閉された容器で行わないでください。 自家蛍光を低減するのに十分なインキュベーション(≥3日間)した後、フリーザーから組織を取り出し、余分な凍結保護剤保存バッファーを取り除き、室温(RT)で40rpmで振とうしながらPBバッファーで組織をそれぞれ10分間3回洗浄します。 約20 mLの酸化アガロース懸濁液(ステップ1で調製)をマイクロ波(700 Wで~30秒)で溶かし、取り扱いができる程度に冷却(~45 °C)して、プラスチック型に流し込みます。注:重要なステップ:サンプル上のマイクロ波で加熱した直後にアガロースを追加しないでください、これは組織を破壊することにつながる可能性があります。 ピンセットを使用してティッシュをそっと持ち上げ、アガロースの下部中央にすばやく挿入します。型をRTで15分間インキュベートし、アガロースを重合させます。 アガロース重合後、プラスチック型を四隅からメスで開き、手袋をはめた指でアガロースキューブを慎重につまみます。 サンプルを水素化ホウ素溶液(ステップ2で調製)に4°Cで2〜3時間浸し、酸化したアガロースと組織の架橋を開始します。これにより、切片化中に組織が剥がれるのを防ぎます。注:重要なステップ:水素化ホウ素に浸漬したサンプルは、4°Cで光から保護してインキュベートする必要があります。 アガロースキューブをPBバッファーで2回10分間洗浄します。組織が上側になるようにアガロースキューブを回し、数滴の瞬間接着剤を使用してブロックを磁気スライド(背面に2つの磁石が取り付けられた顕微鏡スライド)に取り付けます。接着剤が固まるのに10〜20分かかるため、PBバッファーを滴下したペーパーティッシュをアガロースの上に置き、サンプルが全体を通して十分に水和するようにします(図1C)。 3. ミクロトームの準備とステージセッティング 断層撮影装置のサンプルボックスの中央にある金属に磁気スライドを置きます。 ボックスにPBバッファーを充填し、ステージ上に慎重に配置し、左側のネジを締めてサンプルボックスを断層撮影のステージに固定します。注意: ネジを締めすぎると、プラスチックの箱が損傷します。 ブレードをミクロトームに置き、サンプルの位置をミクロトームの近くと下に慎重にシフトします。アガロースの上面は、ミクロトームのブレードと同じレベルにある必要があります。注意: 低すぎる配置は切断時間を無駄にし、高すぎる配置は最初の切断でブロックの大きな塊を削除します。 ステージを動かしてアガロースキューブを対物レンズの中央に配置し、断層撮影ソフトウェアの [スライス ]ボタンを繰り返しクリックして、アガロースキューブ全体の無傷のスライスを取得します。 4. サーフェスの割り当てと2D画像の取得 対物レンズを組織サンプルの中央にX方向とY方向に配置します。 レーザーソフトウェアを開き、ソフトウェアでレーザーをオンにします。カチカチという音が聞こえたら、レーザースイッチをオンにし、波長を800nmに調整します。注:レーザー光源は、イメージングする前に少なくとも30分間、理想的には1時間ウォームアップする必要があります。 顕微鏡のキャビネットのドアを閉じ、部屋のすべての光源をオフにし、PMTをオンにして電圧を750Vに設定します。注:重要なステップ:PMTは光に非常に敏感であるため、キャビネットのドアが閉じられ、部屋のすべての光源がオフになっていない限り、光をオフにしてください。 断層撮影ソフトウェアのプロトコル設定を概説されているように調整し、顕微鏡のシャッターを自動に、電圧をV1とV2の電圧をそれぞれ20と3に設定します。 断層撮影ソフトウェアの 2Dボタンをクリックして 、サンプルのスナップをキャプチャします。 自家蛍光が見える画像が表示されたら、Z-ピエゾを調整して、アガロースキューブの表面に焦点面を設定します。最初のスキャンは、サンプルの安定した画像を取得するために、表面下20μmになります。自家蛍光の背景が見えない場合は、信号が現れるまでコントラストを上げます。目に見える信号がないことがあります(つまり、組織の上部にあるアガロースが原因です)。この場合、Zピエゾデバイスを使用して、Z軸がアガロース表面に到達するまで調整します。目的の位置がZピエゾデバイスの範囲外にある場合は、レンズの手動移動が必要になることがあります。 サンプルの表面を見つけた後、複数の50 μmスライスをカットし、カットのたびに2D画像を取得して、焦点面がブロック面表面に適切に設定されていることを確認します。 5.サンプルのエッジを見つけ、レーザーを始点に設定します レーザースキャン領域のxy座標(4つのコーナー座標)に基づいて、イメージング領域を組織に限定し、周囲のアガロースブロックのイメージングを最小限に抑えます。 光電子増倍管をオフにし、レーザー波長を800nmに設定し、レーザーシャッターを開いてください。アガロースブロックに入射するレーザー光の位置は、散乱光の赤い点として見えます(図2A、B)。重要なステップ:クラス4レーザーには特に注意してください。人間の組織や目に急速に損傷を与える可能性があります。このような機器を安全に操作するには、スタッフに特別なトレーニングが必要です。 ステージをシフトしながらレーザースポットを使用し、背面、右、前面、左のシーケンスを使用して組織エッジの座標を見つけます。 座標を再確認し、レーザースポットを組織のイメージングのデフォルトの出発点である右前隅に配置します。 コンソール ウィンドウからの座標を、xy-steps によって定義される機械で認識可能なブロック サイズに変換します。これらのステップ測定値をソフトウェアのプロトコルに入力します。キャビネットのドアを閉じます。 6. 3Dスキャン/セクショニング 波長を940nmに変更して、GFP、mWasabi、またはYPet、およびPEを励起します。注意: この波長では、レーザーは人間の目には見えません。GFP、mWasabi、およびTIMERbacの緑色発光成分のS/N比を向上させるには、PMT 2の510/20 nm前に狭帯域パスフィルタを配置します。これにより、緑黄色の組織自家蛍光による干渉が減少します。 マイクロスコープのシャッターを自動モードに切り替え、シャッター電圧設定をV1の場合は20、V2の場合は1.71に設定します。 ソフトウェアで次の3つのパラメータを調整します: セクションの厚さ – ほとんどの目的で、50 μmに設定します。肝臓の場合は、イメージング深度が限られているため、30 μmに設定します。物理セクションの数 – これにより、画像化される組織の総深さが決定され、それに応じて設定されます。各セクションでキャプチャする平面の数 – これにより、z解像度が決まります。ほとんどの目的に5つの平面(10μmの垂直分解能が得られます)を使用します。肝臓には3つ以下の平面を使用してください。 レーザーゲインを設定します。これは、さまざまな組織とスキャン深度について経験的にテストする必要があります。 取得した画像を格納するためのフォルダー パスと名前を定義し、イメージング メタファイルに適切な情報を提供します。 入力したすべての値を再確認してください。 3Dモザイク設定をクリックして、スキャンプロセスを開始します(図1D)。 イメージングが完了したら、水タンクから組織切片を慎重に収集し、さらに使用するまで-20°Cの保存バッファーに保存します(図1E;図2C,D)。 7. 画像処理とデータ解析 MATLAB スクリプトを https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020 から Linux コンピューターにダウンロードします。スクリプトをフォルダ(例:/home/user/Program/)にコピーします。注: スクリプトを完全に機能させるには、MATLAB と Fiji (または ImageJ) 用の Computer Vision Toolbox アドオンを Linux コンピューターにインストールする必要があります。 以下で説明するように、タイル画像をステッチします。断層撮影サーバーからLinuxコンピューターにデータを転送します。 MATLAB スクリプト StepOneStitchingAndArchive.m を開き、生データを含むソース フォルダーを見つけます。スクリプトでソース フォルダーと宛先フォルダーを定義します。 [エディター] タブに切り替えて、[ 実行] をクリックします。進行状況の情報は、コマンド ウィンドウに表示されます。この処理には、Mosaicファイルからの情報の読み取り、画像スティッチング前のタイルインデックスの生成、Cidre22 による背景照明補正(図3)、および異なる深度で取得された光学層間の照明補正が含まれます。ソースフォルダ内のstitchedImages_100というサブフォルダでステッチされた画像を見つけます。tar コマンドを使用して、生データを長期保存用に圧縮し、ファイル名拡張子 tar.bz2 で 1 つのファイルとして保存します (図 1F)。 サポートベクターマシンを使用してモデルのトレーニングとセグメンテーションを実行します。サポート ベクター マシンをトレーニングし、セグメンテーションを実行するには、次の手順に従います。注:3つの蛍光チャネルのそれぞれのステッチ画像は、stitchedImages_100の3つのサブフォルダ(1、2、および3、赤、オレンジ、および緑の蛍光に対応する)に保存されます。各サブフォルダには、同じチャネルからスティッチされたすべての画像が含まれています。ステッチされた画像をプレビューします。Fiji(またはImageJ)の各サブフォルダから同じファイル名の画像を1つ開きます。3 つのチャネルを 1 つのカラー イメージに結合します。細菌や組織の自家蛍光から明確なシグナルが見られるまで、各チャンネルの明るさを調整します。次のステップのために、各チャンネルの調整された最大強度レベルに注意してください。 MATLAB スクリプト StepTwoSegmentationAndAnalysis.m を開き、ソースを参照します。トレーニングのソース フォルダーとイメージ名を定義します。例えばソースD = ‘/’ ;red_name = [sourceD ‘1/section_020_01.tif’];green_name = [sourceD ‘2/section_020_01.tif’];blue_name = [sourceD ‘3/section_020_01.tif’]; [エディター] タブに移動し、[ 実行] をクリックします。 色のしきい値を求めるダイアログボックスが表示されるので、フィジーでの以前の手動チェック(ステップ7.3.1)に基づいて入力します。 ダイアログに従って、背景の領域と関心のある領域(バクテリアなど)を選択します。モデルがどの程度適切にトレーニングされているかを示すグラフが表示され、さらに領域を追加する必要があるかどうかを尋ねられます。細菌が明確にセグメント化されるまで、関心領域とバックグラウンドを追加します(図4A、B)。 モデルに名前を付けて保存します。スクリプトは自動的に画像を読み込み、中央値フィルター(半径2ピクセル)を適用します。 セグメンテーション プロセスが自動的に実行され、進行状況情報がコマンド ウィンドウに表示されます。セグメンテーションの進行状況を監視します。セグメンテーションが他のステッチされた画像のモデルでうまく機能しない場合は、モデルのトレーニングを繰り返して、より多くの背景領域と細菌領域を含めます。 セグメンテーションの結果を確認するには、Allpositions_filter3D.txt という名前のファイルを確認します。このファイルには、各細菌または細菌のマイクロコロニーの重心の座標と、対応する積算蛍光強度が含まれています(図1G)。 以下で説明するように、畳み込みニューラルネットワークを使用して追加のアーティファクトを削除します。注:一部の細菌については、Support Vector Machineを使用した単純なセグメンテーションには、まだいくつかのイメージングアーティファクトが含まれています。これは、YPet発現細菌に特に当てはまります。ニューラルネットワークベースのセグメンテーションは、これらのアーティファクトを効率的に除去できます(図4C)。スクリプトを完全に機能させるには、MATLAB と Fiji (または ImageJ) 用の Computer Vision Toolbox アドオンを Windows コンピューターにインストールする必要があります。基になるニューラル ネットワークの詳細については、https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.html を参照してください。画像を準備します。フィジーを使用して、さまざまな明るさ調整でtifファイルをjpgファイルに変換します。手動キュレーションにより、少なくとも600のバクテリアと600のアーティファクトを特定し、これらのオブジェクトの安全にトリミングされた画像を適切なフォルダーに保管します。 MATLAB スクリプト CNNtestV4.m を開き、手順 7.4.1 のオブジェクト イメージを含むソース ファイルを参照します。 トレーニング用の画像フォルダーを定義します。例えばdigitDatasetPath = フルファイル (‘D:\20200602_CNN’,’fortrainingPixel12Folder2′);トレーニング用の画像の数を定義します (例: numTrainFiles = 600)。 [エディター] タブに移動し、[ 実行] をクリックします。トレーニング後、CNN モデル ファイルは gregnet1.mat としてソース フォルダーに保存されます。 テスト画像を含むフォルダーを定義します。例えばdigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).結果は、画像名とバクテリアまたはアーティファクトとしての分類に関する情報を含むファイルYourFile.txtに保存されます。 テスト画像を含むフォルダを定義します。例えばdigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).結果は、画像名とバクテリアまたはアーティファクトとしての分類に関する情報を含むファイルYourFile.txtに保存されます。 以下に説明するように、単一細菌の蛍光強度に基づいてマイクロコロニーのサイズを推定します。注:断層撮影装置の空間分解能は、密集したマイクロコロニー内の個々の細菌細胞を分離するには不十分です。ただし、各マイクロコロニー内の細菌の数は、単一の細菌の蛍光に対するマイクロコロニーの総蛍光に基づいて推定できます。この推定精度は、細菌集団全体の蛍光強度の均一性に依存します。STPトモグラフィーで取得した切片の免疫組織化学を用いてリポ多糖などの細菌成分を染色することにより、STPトモグラフィーにおけるGFP陽性イベントの同定を確認します(図1H; 図 5)。 少なくとも 30 種類の単一細菌を同定し、対応するセグメンテーション結果からそれらの蛍光強度を取り出します。強度の中央値を 1 つの細菌の基準として利用します。マイクロコロニーの総蛍光強度を単一の細菌の基準値で割ることにより、各マイクロコロニーの細菌数を計算します(図1I)。 以下に説明するように、視覚化ソフトウェアを使用して3D再構成を実行します。画像の準備青チャンネルの画像には、組織嚢、動脈、小柱などの有用な解剖学的参照を提供するコラーゲンの第2高調波信号が含まれています。バクテリア用にセグメント化された画像を 2番目の チャネルとして使用します。 1番目の チャンネルの画像を X 軸と Y 軸の両方で 10 倍にビン化し、縮小した画像を新しいフォルダーに保存します。同じフォルダ内で縮小された画像を3回複製します。新しいレプリケートの名前は、同じシーケンスを維持する必要があります。例: section_001_01.tif、名前が section_001_01-copy.tif、section_001_01-copy-copy.tif の 1 をレプリケートします。これらの手順を 2番目の チャネルの画像にも適用します。ダウンサイジングにより、ファイルサイズがより管理しやすくなります。トリプル画像はZ軸を滑らかにします。 各チャネルの画像をマージして、フィジーと画像スタックを形成します。 [イメージ] > [スタック] > [ツール] > [スタック ソーター] > [ラベルで並べ替え] をクリックします。 3Dフィルタリングを実行します。 「3D フィルター>「処理フィルター」>フィルターをクリックし、「 Z フィルターサイズ」を 6 に設定します。画像スタックを保存します。 以下で説明するように、3Dビジュアライゼーションを実行します。視覚化ソフトウェア パッケージをアリーナ ビュー (デフォルト設定) で開きます。ウォッチフォルダアイコンを使用して、アリーナビューにフォルダを追加します。ダブルクリックして、*.imsまたは*.tifファイル(7.6.1で準備)を開きます。 Edit>Image Propertiesを使用して、Display Adjustmentウィンドウでさまざまなチャンネルの色表現(LUT)を調整します。 [詳細設定]をクリックして、最小/最大値とガンマ補正の値を手動で設定します。チャネル名をクリックして、名前と LUT を変更します。 画像の外観を調整したら、スナップショットツールを使用して現在のビューをエクスポートします。 アニメーションアイコンを使用して、3D データをムービーとして表現します。ナビゲーションポインターを使用してパースペクティブ/ビューを見つけてズームし、+ 追加を使用してキーフレームを追加します。別の位置に移動し、次のキーフレームを追加します。 赤の録画 ボタンを押して、ムービーを作成します。目的の宛先フォルダとファイルタイプに保存します(図1J)。