التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأعضاء الكاملة للعدوى الميكروبية
Summary
هنا ، نصف الإجراء الذي يتيح الكشف على مستوى الأعضاء عن البكتيريا المسببة للأمراض أثناء العدوى والقياس الكمي لأنشطة مراسل الفلورسنت.
Abstract
تحدث معظم العدوى داخل أنسجة مضيفة ثلاثية الأبعاد مع تشريح معقد وفسيولوجيا مضيف متغيرة محليا. يؤثر وضع الخلايا الممرضة داخل هذه البيئة المتنوعة بشكل كبير على مستويات التوتر والاستجابات والمصير والمساهمة في التقدم العام للمرض وفشل العلاج. ومع ذلك ، نظرا للصعوبات التقنية في تحديد موقع الخلايا الممرضة بحجم ميكرومتر داخل الأعضاء المضيفة بحجم سم ، لم يتم استكشاف هذا المجال من البحث نسبيا. هنا ، نقدم طريقة لمواجهة هذا التحدي. نحن نستخدم التصوير المقطعي التسلسلي ثنائي الفوتون وتحليل الصور المحسن الذكاء الاصطناعي لتحديد موقع خلايا السالمونيلا الفردية في جميع أنحاء الطحال وفصوص الكبد والغدد الليمفاوية الكاملة للفئران المصابة. باستخدام مراسلي الفلورسنت وإدارة الأجسام المضادة في الجسم الحي ، يمكن تحديد معدل تكرار خلايا السالمونيلا المفردة ، وتفاعلها المحلي مع خلايا مناعية معينة ، والاستجابات البكتيرية للمضادات الحيوية. تفتح هذه المنهجيات سبلا لإجراء فحص شامل للعدوى والوقاية منها وعلاجها في سياق الأنسجة ثلاثية الأبعاد.
Introduction
تحدث العدوى في الأنسجة ذات التشريح المعقد وعلم وظائف الأعضاء المجزأة. يمكن للبيئات الدقيقة المتنوعة التي تتعايش في الأنسجة المصابة تحديد مصير المجموعات الفرعية الممرضة المحلية ومساهماتها في النتيجة الإجماليةللمرض 1،2،3. ومع ذلك ، لا يزال رسم الخرائط ثلاثية الأبعاد الشامل لمسببات الأمراض الميكروبية في الأنسجة بحجم سم يمثل تحديا4. يعد تصوير الدماغ والأعضاء الأخرى مجالا بحثيا نشطا للغاية مع تحسين الاستراتيجيات التجريبية باستمرار5 ، ولكن لا تزال العديد من الطرق تفتقر إلى الدقة دون ميكرومتر التي ستكون مطلوبة لتحديد مسببات الأمراض البكتيرية بحجم ميكرومتر بثقة. في المقابل ، يتيح التصوير المقطعي التسلسلي ثنائي الفوتون( STP) 6 التصوير الآلي متعدد الألوان والخالي من التشوه للأنسجة بأكملها بدقة دون ميكرومتر داخل المستوى ، مما ينتج عنه مجموعات بيانات حجمية كاملة. تجمع هذه الطريقة بين التقسيم المادي المتكرر للأنسجة باستخدام اهتزاز مع تصوير متقطع ثنائي الفوتون لوجوه الكتلة الناشئة مع ضوء الأشعة تحت الحمراء. تم استخدام التصوير المقطعي STP على نطاق واسع لرسم خرائط محاور رقيقة في الدماغ لإنشاء خرائط اتصال7،8،9،10.
يتيح التصوير المقطعي STP أيضا رسم خرائط ثلاثية الأبعاد للخلايا الممرضة الميكروبية الفردية (السالمونيلا ، التوكسوبلازما) في الأنسجة المصابة بأكملها11,12 باستخدام التصوير المقطعي. يكشف الجيل الثاني من التوافقي عن أغماد الكولاجين حول الشرايين وفي العصابات الليفية مثل ترابيق الطحال ، مما يوفر سياقا تشريحيا. يمكن استخدام الأجسام المضادة الفلورية المحقونة في الجسم الحي لتلطيخ الخلايا المضيفة للكشف عن التفاعلات بين الخلايا المسببة للأمراض الفردية والخلايا المناعية المتسللة مثل العدلات. هنا ، يتم وصف خط الأنابيب الذي يتضمن معالجة الأنسجة ، والتصوير ، وخياطة بلاط التصوير مع تصحيح الإضاءة ، وتكديس الصور في ثلاثة أبعاد ، والتجزئة باستخدام أدوات التعلم الآلي. ينتج خط الأنابيب هذا مواقع 3D لخلايا مسببات الأمراض الفردية والمستعمرات الدقيقة داخل سياقها المضيف. لا يزال حساب عدد الخلايا الفردية داخل المستعمرات الدقيقة أمرا صعبا بسبب حدود الدقة ، ولكن يمكن تقدير هذه الأرقام بناء على السطوع المتكامل للمستعمرة الدقيقة. يمكن تكييف خط الأنابيب بسهولة مع نماذج العدوى الأخرى إذا توفرت مسببات الأمراض المعبرة عن GFP أو YFP المؤتلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد سياق الأنسجة المحلية لمسببات الأمراض البكتيرية أمرا بالغ الأهمية لتحديد هجمات المضيف المحلي ، والتكيفات البكتيرية ، والنتيجة المحلية لتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة والعلاج الكيميائي المضاد للميكروبات ، والمساهمات الفردية في النتيجة الإجمالية للمرض. كان تصوير البكتيريا بحجم ميكرومتر في أعضاء بحجم سنتيمتر أمرا صعبا. يوفر التصوير المقطعي التسلسلي ثنائي الفوتون (STP) دقة مكانية كافية للكشف عن الخلايا البكتيرية الفردية في الأعضاء بأكملها ، والتقسيم والتصوير الآلي ، وإنتاجية كافية (~ 1 عضو في اليوم) 11. بينما يمكن تلطيخ مولدات الضد المضيفة في الجسم الحي ، يجب أن تعبر الخلايا الممرضة عن بروتينات فلورية مناسبة لضمان الكشف الشامل عن الخلايا المسببة للأمراض داخل الخلايا. تشكل مجموعات البيانات الناتجة (0.5-1.5 تيرابايت لكل عضو) تحديات كبيرة للبنى التحتية لتكنولوجيا المعلومات لتحليل البيانات وتخزينها.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذه الطريقة. أولا ، مطلوب سلالة ممرضة مع تعبير متجانس وقابل للكشف عن البروتين الفلوري GFP أو YFP. من الناحية المثالية ، يتم استخدام شريط تعبير كروموسومي25 لتقليل عدم تجانس التألق بسبب اختلاف عدد نسخ البلازميد. مطلوب كثافة مضان كافية ولكن يجب تجنب المستويات المفرطة من البروتين الفلوري لتجنب ضعف اللياقة البدنية للممرض23. يمكن الحصول على مستويات التعبير المناسبة عن طريق اختيار المروج المناسب وضبط موقع ربط الريبوسوم25 أو المنطقة غير المترجمة 5 ‘بأكملها (UTR)26. ثانيا ، يجب أن يتضمن تثبيت التروية غسلا أوليا بمحلول لإزالة أكبر عدد ممكن من كريات الدم الحمراء من الدورة الدموية. هذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص للطحال والكبد (على الرغم من صعوبة إزالة كرات الدم الحمراء الكاملة من هذه الأعضاء). تمتص كريات الدم الحمراء المتبقية الضوء في الجزء المرئي من الطيف مما يضر بجودة التصوير27. ثالثا ، يعد تخزين الأنسجة الثابتة في المادة الواقية من البرد أمرا بالغ الأهمية لتقليل التألق الذاتي للأنسجة ، والذي يكون مرتفعا بشكل خاص في الأنسجة الملتهبة ويمكن أن يلقي بظلاله على التألق الضعيف نسبيا للخلايا المسببة للأمراض11. رابعا ، يعد الربط المتقاطع الفعال للأنسجة بكتلة الأغاروز المحيطة أمرا بالغ الأهمية لقطع الاهتزاز السلس دون أن يقفز النسيج من كتلة الأغاروز. خامسا ، يجب التحقق بشكل مستقل من الإشارات الفلورية وتحديدها كخلايا ممرضة باستخدام مناهج متعامدة مثل تلطيخ الأجسام المضادة لمكونات مسببات الأمراض (مثل عديد السكاريد الدهني للبكتيريا سالبة الجرام) والفحص المجهري متحد البؤر للأقسام المستردة من التصوير المقطعي11. تحتوي بعض الأنسجة المصابة على جسيمات فلورية ذاتية ذات شكل مماثل وأطياف مضان متداخلة يمكن أن يساء تفسيرها بسهولة على أنها خلايا ممرضة. سادسا ، يجب مقارنة كمية الخلايا الممرضة داخل المستعمرات الدقيقة بالنهج المتعامدة مثل الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم الدقة. يجب التحقق من الأحمال البكتيرية الإجمالية بناء على هذه الحسابات بالمقارنة مع الأساليب المتعامدة مثل قياس التدفق الخلوي والطلاء.
تتضمن التعديلات المهمة لبروتوكول STP المستخدم على نطاق واسع وضع مرشح تمرير النطاق الضيق 510/20 نانومتر أمام المضاعف الضوئي 211 ، لتقليل تداخل التألق الذاتي الأخضر والأصفر القوي بشكل خاص في الكبد والطحال وبقع باير المصابة والملتهبة. كما أن التألق الذاتي القوي وزيادة تشتت الضوء لهذه الأعضاء مقارنة بالدماغ (الذي يهيمن على التطبيقات الأخرى ل STP) يولد أيضا حاجة إلى تصحيح أكثر فعالية للإضاءة غير المتساوية. كتعديل آخر ، يستخدم هذا البروتوكول نهج CIDRE22 لهذا الغرض (الشكل 3) وتجزئة البكتيريا القائمة على الذكاء الاصطناعي. أخيرا ، تم تغيير المعالجة المسبقة للأنسجة من خلال تضمين خطوة حضانة في مادة واقية من التبريد عند -20 درجة مئوية مما يقلل من التألق الذاتي للأنسجة وبالتالي يسهل الكشف عن الخلايا الممرضة الصغيرة ذات التألق الضعيف نسبيا11.
قد يكون استكشاف الأخطاء وإصلاحها ضروريا إذا لم يتم اكتشاف إشارات مسببات الأمراض ، أو إذا أدى التجزئة إلى حساسية غير كافية (يتم تفويت عدد كبير جدا من الخلايا المسببة للأمراض) أو دقة غير كافية (يتم تقسيم الكثير من جزيئات الخلفية كخلايا ممرضة). إذا كان من الممكن اكتشاف التألق الذاتي للأنسجة الخلفية ولكن هناك عدد قليل جدا من إشارات مسببات الأمراض ، فقد تحتوي مسببات الأمراض على كميات غير كافية من البروتينات الفلورية. يمكن اختبار ذلك باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لأقسام الأنسجة من نفس الأنسجة المصابة أو قياس التدفق الخلوي لمتجانسات الأنسجة19,28. قد تكون الأسباب الكامنة وراء ذلك هي عدم كفاية مستويات التعبير أو عدم استقرار شريط التعبير. يمكن أن تشمل استراتيجيات التخفيف محفزات بديلة لدفع التعبير ، أو تكييف الكودونات للجينات التي تشفر البروتين الفلوري لأنواع مسببات الأمراض ، أو استخدام تركيبات عرضية ذات عدد نسخ أعلى ، أو تثبيت أشرطة التعبير عن طريق التكامل الكروموسومي أو التكامل القاتل المتوازن29. يعد اختيار البروتين الفلوري مهما أيضا ، ولكن الاكتشاف ممكن باستخدام GFP.mut2 و mWasabi و YPet و TIMERbac. إذا كان التقسيم غير دقيق ، فقد يكون سبب ذلك هو مضان ممرض ضعيف للغاية يمكن معالجته كما هو موضح أعلاه ، أو خلفية عالية جدا من التألق الذاتي للأنسجة. قد يؤدي التروية الواسعة لمحلول الغسيل أو الحضانة المطولة في مخزن التخزين المؤقت مباشرة قبل التضمين في كتلة الأغاروز والتصوير المقطعي إلى حل هذه المشكلات. أخيرا ، هناك حاجة إلى تدريب كاف للشبكة العصبية للتصنيف الدقيق ، ولكن التدريب المفرط يمكن أن يؤدي إلى الإفراط في التجهيز الذي يضعف أداء العينات الجديدة.
حاليا ، لا توجد طريقة أخرى يمكنها تصوير أعضاء كاملة بدقة مكانية كافية في 3D للكشف عن البكتيريا الفردية. قد تحقق التحسينات المستقبلية في إزالة الأنسجة والفحص المجهري للصفائح الضوئية دقة مماثلة. قد يتيح ذلك التصوير بسرعة أعلى ومع المزيد من قنوات الفلورسنت.
أحد القيود المهمة على STP هو دقة البكسل داخل المستوى ~ 0.5 ميكرومتر والدقة الرأسية من 5 إلى 10 ميكرومتر ، وهي غير كافية لحل البكتيريا الموجودة عن كثب ، على سبيل المثال ، داخل مستعمرة صغيرة مكتظة بكثافة. ومع ذلك ، من الممكن استرداد أقسام الأنسجة بعد التصوير المقطعي للفحص المجهري الثانوي عالي الدقة لأجزاء الأنسجة المختارة. هناك قيد آخر على STP وهو توفر ثلاث قنوات مضان فقط ، مما يحد من عدد الفلوروفورات التي يمكن تصويرها في وقت واحد. مرة أخرى ، يمكن أن يكشف التحليل الثانوي لأقسام الأنسجة المسترجعة بطرق تعدد الإرسال عن موقع وشدة العديد من العلامات لأجزاء الأنسجة المختارة. يمكن دمج هذه المعلومات في بنية 3D الشاملة للأنسجة المحيطة على النحو المحدد مع STP.
في الختام ، يتيح هذا البروتوكول إجراء تحقيقات مفصلة للتفاعلات بين المضيف والممرض على المستوى المحلي ومستوى العضو الكامل. يجب أن يكون البروتوكول قابلا للتكيف بسهولة مع مسببات الأمراض الأخرى (بشرط أن يتم الحصول عليها كسلالات فلورية) ، والأعضاء الأخرى ، والأنواع المضيفة المختلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية 310030_156818 و 310030_182315 و NCCR_ 180541 AntiResist (إلى DB).
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
| Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
| Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
| Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
| Equipment | |||
| Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
| MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
| Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
| TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
| Antibody/dyes | |||
| DAPI | Merck | D9542-5MG | |
| Primary antibodies | |||
| anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
| anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
| anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | ||
| chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
| Software | Company | Version | |
| Fiji | Image J | 1.54g or later | |
| MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
| Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
| Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |
References
- Bjarnsholt, T., et al. The importance of understanding the infectious microenvironment. Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).
- Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. The biogeography of infection revisited. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).
- Bumann, D., Cunrath, O. Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues. Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).
- Hofmann, J., Keppler, S. J. Tissue clearing and 3D imaging – putting immune cells into context. J Cell Sci. 134 (15), jcs258494 (2021).
- Blain, R., et al. A tridimensional atlas of the developing human head. Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).
- Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Kim, Y., et al. Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism. Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).
- Matho, K. S., et al. Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex. Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).
- Muñoz-Castañeda, R., et al. Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).
- Li, J., et al. Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118 (2021).
- Dogga, S. K., et al. Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
- Claudi, B., et al. Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy. Cell. 158 (4), 722-733 (2014).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6, 13 (2008).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Burton, N. A., et al. Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice. Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
- de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study. J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Wendland, M., Bumann, D. Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection. FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).
- Barat, S., et al. Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens. PLoS Pathog. 8 (10), e1002966 (2012).
- Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).
- Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. 5’UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability. Front Microbiol. 13, 1088941 (2022).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Bumann, D. Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry. Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).
- Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t. Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella. vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).
