Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

Todos los experimentos con animales descritos aquí han sido aprobados por las autoridades (licencia 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) y siguen las directrices locales (Tierschutz-Verordnung, Basilea) y la ley suiza de protección animal (Tierschutz-Gesetz). 1. Preparación y almacenamiento de tejidos infectados Utilice un modelo de infección de su elección. Aquí, ratones de 10 a 16 semanas de edad de ambos sexos están infectados con ~ 1,000 unidades formadoras de colonias (UFC) por inyección intravenosa o 5 x 107 UFC por administración intragástrica con una aguja de punta redonda. Las cepas de ratón adecuadas incluyen BALB/c y C57BL/6.NOTA: El mismo enfoque se puede adaptar fácilmente para otras especies hospederas. Asegúrese de que los patógenos expresen proteínas fluorescentes para permitir su identificación en el tejido no teñido. Los patógenos que expresan GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 o mWasabi16 se pueden visualizar utilizando una excitación de 940 nm17. La salmonela que expresa mCherry18 a niveles fácilmente detectables por citometría de flujo19 podría obtenerse utilizando una excitación de 800 nm, pero tiene una mala relación señal-fondo en el bazo y el hígado infectados, que muestran una autofluorescencia sustancial. Asegúrese de que todas las proteínas fluorescentes conserven el >70% de su intensidad de fluorescencia después de la fijación con paraformaldehído a pH neutro basada en la cuantificación con citometría de flujo. Aquí, se utiliza tejido de ratón infectado, a saber, bazo, hígado, ganglios linfáticos y parches de Peyer. Teñir los marcadores de superficie de la célula huésped in vivo inyectando anticuerpos marcados con ficoeritrina (PE) 10 min antes de la perfusión. Para teñir los neutrófilos, inyecte por vía intravenosa 4 μg de anti-Ly-6G-PE en 100 μL de PBS. Para teñir los macrófagos de la zona marginal en el bazo, inyectar 4 μg de anti-CD169-PE en 100 μL de PBS (ver Tabla de Materiales). Fijar los tejidos infectados mediante perfusión transcárdica estándar20 con 15 mL de tampón de fosfato 50 mM helado (PB; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7,4), seguido de 35 mL de paraformaldehído al 4% (PFA; fijador) en PB (Figura 1A).En resumen, administrar anestesia profunda al animal infectado mediante inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina y 16 mg/kg de xilacina. Asegure una anestesia adecuada confirmando la pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie. Desinfecte el pelaje con etanol al 70%, séquelo con una toalla de papel estéril y abra quirúrgicamente el pecho con pinzas y tijeras. Coloque una aguja estéril en el ventrículo izquierdo del corazón, abra la aurícula derecha con tijeras estériles y pase el primer tampón y luego el fijador a través de la aguja, el ventrículo izquierdo y todo el sistema vascular con una bomba. Esto fija todos los tejidos de forma rápida y uniforme y provoca la eutanasia. Recoja el tejido después de la perfusión, incube en un volumen 20x de paraformaldehído frío al 4% en tampón PB y colóquelo en un agitador a 4 °C durante la noche (Figura 1B). La obtención de imágenes es posible para tejidos en el rango de tamaño de 0,05 a 2 cm3. Para pañuelos más grandes, córtelos en trozos adecuados. Al día siguiente, lave el pañuelo 3 veces durante 10 minutos cada una con tampón PB agitando a 40 rpm a temperatura ambiente para eliminar el PFA.NOTA: Debido a la toxicidad del PFA, estos pasos deben llevarse a cabo dentro de una campana extractora. Deseche los residuos de PFA de acuerdo con las pautas institucionales. Retirar el exceso de tampón PB y añadir 20x volumen de tampón de almacenamiento crioprotector21 (876 mM de sacarosa, 0,25 mM de polivinilpirrolidona, 40% (v/v) de etilenglicol, disuelto en 50 mM de tampón PB) a la muestra agitando a 40 rpm a 4 °C durante 6-8 h o hasta que los tejidos se hundan hasta el fondo. Incubar las muestras a -20 °C durante al menos 3 días para garantizar una reducción eficaz de la autofluorescencia tisular11. Las muestras se pueden utilizar hasta 5 años cuando se almacenan a -20 °C.NOTA: El hundimiento del tejido indica la penetración adecuada del tampón de almacenamiento en el tejido. 2. Incrustación de muestras Incruste el tejido en un bloque de agarosa para un corte suave con un vibrátomo. Preactive la agarosa químicamente por oxidación con periodato y luego reduzca con borohidruro para formar reticulación con el tejido para mejorar la estabilidad durante el proceso de corte. Realice los pasos que se describen a continuación. Preparar agarosa oxidada al 4% pesando 2,25 g de agarosa y añadir 0,21 g de NaIO4. Añadir 100 mL de PB a la agarosa y NaIO4. Remover a temperatura ambiente en una campana extractora durante 2-3 h con protección contra la luz.NOTA: Paso crítico: No exceda la agitación durante más de 3 h o la agarosa se polimerizará mal. Recuperar la agarosa por filtración por membrana en un filtro de vacío estándar con una membrana de 0,2 μm. Elimine el NaIO4 restante lavando 3 veces con 50 ml de tampón PB. Vuelva a suspender la agarosa oxidada en 50 mL de tampón PB.NOTA: No derrita la agarosa durante esta etapa. La agarosa puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2-3 semanas protegida de la luz. Prepare la solución de borohidruro añadiendo 19 g de bórax y 3 g de ácido bórico a 1 L de agua. Revuelva hasta que se disuelva y ajuste el pH a 9-9.5 con 1 M de NaOH. En una placa de agitación en una campana extractora, calentar 100 ml de tampón de borato a 40 °C. Añadir 0,2 g de NaBH4 y remover durante 15-30 min mientras se protege de la luz.NOTA: La solución de borohidruro se puede almacenar durante varias semanas a temperatura ambiente en la oscuridad. Paso crítico: Al agregar NaBH4 al tampón de borato, se formará gas, por lo tanto, realice este paso dentro de una campana extractora. No realice este paso en un recipiente herméticamente cerrado porque podría provocar una explosión. Tome el tejido del congelador después de una incubación suficiente para reducir la autofluorescencia (≥ 3 días), elimine el exceso de tampón de almacenamiento de crioprotector y lave el tejido 3 veces durante 10 minutos cada uno con tampón PB agitando a 40 rpm a temperatura ambiente (RT). Derretir aproximadamente 20 mL de suspensión de agarosa oxidada (preparada en el paso 1) en un microondas (700 W durante ~30 s), dejar que se enfríe lo suficiente como para manipularla (~45 °C) y verterla en un molde de plástico.NOTA: Paso crítico: No agregue la agarosa directamente después de calentarla en el microondas sobre la muestra, esto podría llevar a la destrucción del tejido. Use una pinza para recoger suavemente el pañuelo e insertarlo rápidamente en la parte inferior central de la agarosa. Incubar el molde en RT durante 15 minutos para permitir que la agarosa se polimerice. Después de la polimerización de la agarosa, abra el molde de plástico con un bisturí desde sus cuatro esquinas y recoja con cuidado el cubo de agarosa con los dedos enguantados. Sumerja la muestra en una solución de borohidruro (preparada en el paso 2) durante 2-3 h a 4 °C para iniciar la reticulación de la agarosa oxidada y el tejido. Esto evita que el tejido se desprenda durante el corte.NOTA: Paso crítico: La muestra sumergida en borohidruro debe incubarse protegida de la luz a 4 °C. Lave el cubo de agarosa con tampón PB 2 veces durante 10 min. Gire el cubo de agarosa de modo que el tejido quede en la parte superior y fije el bloque a un portaobjetos magnético (portaobjetos de microscopio con dos imanes unidos a la parte posterior) utilizando unas gotas de adhesivo instantáneo. El pegamento tarda entre 10 y 20 minutos en solidificarse, así que coloque un pañuelo de papel con gotas de tampón PB encima de la agarosa, asegurándose de que la muestra permanezca adecuadamente hidratada en todo momento (Figura 1C). 3. Preparación del micrótomo y montaje del escenario Coloque el portaobjetos magnético sobre el metal en el centro de la caja de muestras del tomógrafo. Llene la caja con tampón PB y colóquela con cuidado en la platina y apriete el tornillo de la izquierda para asegurar la caja de muestras en la platina del tomógrafo.NOTA: No apriete demasiado los tornillos, ya que dañará la caja de plástico. Coloque la cuchilla en el micrótomo y cambie la posición de la muestra con cuidado cerca y debajo del micrótomo. La superficie superior de la agarosa debe estar al mismo nivel que la hoja del micrótomo.NOTA: Colocarlo demasiado bajo perderá tiempo de corte, mientras que colocarlo demasiado alto eliminará una gran parte del bloque en el primer corte. Mueva la plataforma para colocar el cubo de agarosa en el centro del objetivo y haga clic repetidamente en el botón Slice en el software del tomógrafo hasta que obtenga una porción intacta de todo el cubo de agarosa. 4. Asignación de la superficie y adquisición de imágenes 2D Centre la lente del objetivo en la muestra de tejido en las direcciones x e y. Abra el software del láser y encienda el láser en el software. Al escuchar un tic-tac, encienda el interruptor láser y ajuste la longitud de onda a 800 nm.NOTA: La fuente láser debe calentarse durante al menos 30 minutos, idealmente 1 hora, antes de la toma de imágenes. Cierre las puertas del gabinete del microscopio, apague todas las fuentes de luz de la habitación, encienda los PMT y ajuste el voltaje a 750 V.NOTA: Paso crítico: Los PMT son muy sensibles a la luz, manténgalos apagados a menos que las puertas del gabinete estén cerradas y todas las fuentes de luz de la habitación estén apagadas. Ajuste la configuración del protocolo del software del tomógrafo como se describe y configure el obturador del microscopio en automático y el voltaje en 20 y 3 para V1 y V2, respectivamente. Haga clic en el botón 2D en el software del tomógrafo para capturar una instantánea de la muestra. Una vez que aparezca una imagen con autofluorescencia visible, ajuste el z-piezo para establecer el plano focal en la superficie del cubo de agarosa. El primer escaneo será a 20 μm bajo la superficie para adquirir una imagen estable de la muestra.Si no hay un fondo de autofluorescencia visible, aumente el contraste hasta que aparezca una señal. Puede ocurrir que no haya una señal visible (es decir, debido a la agarosa en la parte superior del tejido). En este caso, ajuste el eje z con el dispositivo piezoeléctrico z hasta que llegue a la superficie de agarosa. Es posible que sea necesario el movimiento manual de la lente si la posición deseada está fuera del alcance del dispositivo z-piezoeléctrico. Corte varios cortes de 50 μm después de encontrar la superficie de la muestra y adquiera imágenes 2D después de cada corte para asegurarse de que el plano focal esté configurado correctamente en la superficie de la cara del bloque. 5. Encontrar los bordes de las muestras y ajustar el láser al punto de partida En función de las coordenadas xy del área de escaneo láser (4 coordenadas de esquina), limite el área de imagen al tejido con una imagen mínima del bloque de agarosa circundante. Apague los PMT, ajuste la longitud de onda del láser a 800 nm, cambie el obturador láser para que se abra. La posición de la luz láser que ingresa al bloque de agarosa es visible como un punto rojo de luz dispersa (Figura 2A, B).Paso crítico: Tenga especial cuidado con el láser de clase 4. Puede dañar rápidamente los tejidos humanos y los ojos. El personal necesita una capacitación especial para operar un instrumento de este tipo de manera segura. Utilice el punto láser mientras desplaza la platina para encontrar las coordenadas de los bordes del tejido utilizando la secuencia atrás, derecha, delante e izquierda. Vuelva a verificar las coordenadas y coloque el punto láser en la esquina frontal derecha, que es el punto de inicio predeterminado para obtener imágenes del tejido. Convierta las coordenadas de la ventana de la consola en tamaños de bloque reconocibles por la máquina, que se definen mediante los pasos xy. Introduzca estas mediciones de pasos en el protocolo del software. Cierre las puertas del armario. 6. 3D escaneo / seccionamiento Cambie la longitud de onda a 940 nm para excitar GFP, mWasabi o YPet y PE.NOTA: El láser es invisible para el ojo humano en esta longitud de onda. Para mejorar la relación señal-fondo para GFP, mWasabi y el componente emisor de verde de TIMERbac, coloque un filtro de paso de banda estrecho de 510/20 nm delante de PMT 2. Esto reduce la interferencia de la autofluorescencia tisular verde-amarilla. Cambie el obturador del microscopio al modo automático y los ajustes de voltaje del obturador a 20 para V1 y 1,71 para V2. Ajuste los siguientes tres parámetros en el software: Espesor de la sección: para la mayoría de los propósitos, establézcalo en 50 μm. Para el hígado, se establece en 30 μm debido a la profundidad de imagen limitada. El número de secciones físicas: esto determina la profundidad total del tejido que se obstruirá en consecuencia, establecida en consecuencia. El número de planos a capturar para cada sección: esto determinará la resolución z. Utilice 5 planos (con una resolución vertical de 10 μm) para la mayoría de los propósitos. Para el hígado use 3 o menos planos. Ajuste la ganancia del láser. Esto debe probarse empíricamente para diferentes tejidos y profundidad de escaneo. Defina la ruta de acceso y el nombre de la carpeta para almacenar las imágenes adquiridas y proporcione la información adecuada para el metarchivo de imágenes. Vuelva a comprobar todos los valores introducidos. Haga clic en la configuración de mosaico 3D para iniciar el proceso de escaneo (Figura 1D). Una vez completadas las imágenes, recoja cuidadosamente las secciones de tejido del tanque de agua y guárdelas en un tampón de almacenamiento a -20 °C hasta su uso posterior (Figura 1E; Figura 2C,D). 7. Procesamiento de imágenes y análisis de datos Descargue los scripts de MATLAB en un equipo Linux desde https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020. Copie los scripts en una carpeta, por ejemplo, /home/user/Program/.NOTA: El complemento Computer Vision Toolbox para MATLAB y Fiji (o ImageJ) debe estar instalado en equipos Linux para que el script sea completamente funcional. Cose las imágenes de los mosaicos como se describe a continuación.Transfiera datos desde el servidor del tomógrafo a la computadora Linux. Abra el script de MATLAB StepOneStitchingAndArchive.m y localice la carpeta de origen que contiene los datos sin procesar. Defina las carpetas de origen y destino en el script. Cambie a la pestaña Editor y haga clic en Ejecutar. La información de progreso se muestra en la ventana de comandos. El procesamiento incluye la lectura de la información del archivo Mosaic, la generación del índice de mosaico antes de la unión de la imagen, la corrección de la iluminación de fondo con Cidre22 (Figura 3), así como la corrección de la iluminación entre capas ópticas adquiridas a diferentes profundidades. Busque las imágenes unidas en una subcarpeta llamada stitchedImages_100 en la carpeta de origen. Comprima los datos sin procesar para el almacenamiento a largo plazo utilizando el comando tar y guárdelos como un solo archivo con la extensión de nombre de archivo tar.bz2 (Figura 1F). Realice el entrenamiento y la segmentación del modelo con la máquina de vectores de soporte. Para entrenar la máquina de vectores de soporte y realizar la segmentación, siga los pasos que se indican a continuación.NOTA: Las imágenes unidas para cada uno de los tres canales de fluorescencia se almacenan en 3 subcarpetas (denominadas 1, 2 y 3, correspondientes a la fluorescencia roja, naranja y verde) de stitchedImages_100. Cada subcarpeta contiene todas las imágenes unidas del mismo canal.Obtenga una vista previa de las imágenes unidas. Abra una imagen con el mismo nombre de archivo de cada subcarpeta con Fiji (o ImageJ). Fusiona los tres canales en una imagen a color. Ajuste el brillo de cada canal hasta que se vean señales claras de las bacterias y la autofluorescencia de los tejidos. Tenga en cuenta el nivel de intensidad máxima ajustado de cada canal para el siguiente paso. Abra el script de MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m y vaya al código fuente. Defina la carpeta de origen y los nombres de las imágenes para el entrenamiento. Por ejemplofuenteD = ‘/’ ;red_name = [fuenteD ‘1/section_020_01.tif’]; green_name = [fuenteD ‘2/section_020_01.tif’];blue_name = [fuenteD ‘3/section_020_01.tif’]; Vaya a la pestaña Editor y haga clic en Ejecutar. Aparecerá un cuadro de diálogo solicitando umbrales de color, rellénelo según la verificación manual previa con Fiji (paso 7.3.1). Seleccione las regiones para el fondo y las regiones de interés (es decir, bacterias) de acuerdo con los cuadros de diálogo. Aparecerá gráficos que muestran qué tan bien se ha entrenado el modelo y preguntarán si es necesario agregar más regiones. Agregue más regiones de interés y antecedentes hasta que las bacterias puedan segmentarse claramente (Figura 4A, B). Asigne un nombre al modelo y guárdelo. El script cargará automáticamente las imágenes y aplicará un filtro mediano (radio de 2 píxeles). El proceso de segmentación se ejecuta automáticamente y la información de progreso se muestra en la ventana de comandos. Observa el progreso de la segmentación. Si la segmentación no funciona bien con el modelo en otras imágenes unidas, repita el entrenamiento del modelo para incluir más regiones bacterianas y de fondo. Para ver los resultados de la segmentación, compruebe el archivo denominado Allpositions_filter3D.txt. Este fichero contiene las coordenadas del centro de gravedad de cada bacteria o microcolonia bacteriana y la correspondiente intensidad de fluorescencia integrada (Figura 1G). Elimine los artefactos adicionales con la red neuronal convolucional como se describe a continuación.NOTA: Para algunas bacterias, la segmentación simple con la máquina de vectores de soporte todavía incluye algunos artefactos de imagen. Esto es particularmente cierto para las bacterias que expresan YPet. La segmentación basada en redes neuronales puede eliminar eficazmente estos artefactos (Figura 4C). El complemento Computer Vision Toolbox para MATLAB y Fiji (o ImageJ) debe estar instalado en equipos Windows para que el script sea completamente funcional. Para obtener información sobre la red neuronal subyacente, consulte: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.htmlPrepara las imágenes. Convierta archivos tif a archivos jpg con diferentes ajustes de brillo usando Fiji. Identifique con la curación manual al menos 600 bacterias y 600 artefactos y guarde imágenes recortadas de estos objetos en las carpetas adecuadas. Abra el script de MATLAB CNNtestV4.m y busque los archivos de origen que contienen las imágenes de objeto del paso 7.4.1. Defina la carpeta de imágenes para el entrenamiento. Por ejemplodigitDatasetPath = archivo completo (‘D:\20200602_CNN’,’fortrainingPixel12Folder2′);Defina el número de imágenes para el entrenamiento, por ejemplo, numTrainFiles = 600. Vaya a la pestaña Editor y haga clic en Ejecutar. Después del entrenamiento, el archivo de modelo CNN se guarda como gregnet1.mat en la carpeta de origen. Defina una carpeta con imágenes de prueba. Por ejemplodigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).Los resultados se guardan en un archivo YourFile.txt que contiene información sobre el nombre de la imagen y la clasificación como bacteria o artefacto. Defina la carpeta con imágenes de prueba. Por ejemplodigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).Los resultados se guardarán en un archivo YourFile.txt, que contiene información sobre el nombre de la imagen y la clasificación como bacteria o artefacto. Estime el tamaño de las microcolonias en función de la intensidad de fluorescencia de las bacterias individuales, como se describe a continuación.NOTA: La resolución espacial del tomógrafo es insuficiente para resolver células bacterianas individuales dentro de microcolonias densamente empaquetadas. Sin embargo, el número de bacterias en cada microcolonia puede estimarse en función de la fluorescencia total de la microcolonia en relación con la fluorescencia de una sola bacteria. La precisión de esta estimación depende de la homogeneidad de la intensidad de la fluorescencia en toda la población bacteriana.Confirmar la identidad de eventos positivos para GFP en la tomografía STP mediante la tinción de componentes bacterianos como el lipopolisacárido mediante inmunohistoquímica de las secciones recuperadas del tomógrafo (Figura 1H; Figura 5). Identifique al menos 30 bacterias individuales y recupere su intensidad de fluorescencia a partir de los resultados de segmentación correspondientes. Utilice el valor de la intensidad mediana como referencia para una sola bacteria. Calcule el número bacteriano de cada microcolonia dividiendo la intensidad de fluorescencia total de la microcolonia por el valor de referencia para una sola bacteria (Figura 1I). Realice la reconstrucción 3D con software de visualización como se describe a continuación.Preparación de la imagenTome las imágenes del canal azul, que contienen señales de segundo armónico de colágeno que proporcionan una referencia anatómica útil que incluye cápsulas de tejido, arterias y trabéculas. Utilice imágenes segmentadas para bacterias como el2º canal. Agrupe las imágenes del 1ercanal 10 veces en los ejes x e y y guarde las imágenes reducidas en una nueva carpeta. Realice 3 réplicas de imágenes reducidas dentro de la misma carpeta. El nombre de las nuevas réplicas debe mantener la misma secuencia. Por ejemplo: section_001_01.tif, replicar 1 con el nombre section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Aplique estos pasos también a las imágenes del2º canal. La reducción de tamaño produce tamaños de archivo más manejables. Las imágenes triples suavizarán el eje z. Combine las imágenes de cada canal para formar pilas de imágenes con Fiji. Haga clic en Imagen > Pilas > Herramientas > Clasificador de pilas > Ordenar por etiquetas. Realizar filtrado 3D. Haga clic en Procesar filtros > > filtro 3D y establezca el tamaño del filtro Z en 6. Guarde las pilas de imágenes. Realice la visualización 3D como se describe a continuación.Abra el paquete de software de visualización en la vista Arena (configuración predeterminada). Utilice el icono de la carpeta de inspección para añadir carpetas a la vista de Arena. Haga doble clic para abrir el archivo *.ims o *.tif (preparado en 7.6.1). Con Editar > Propiedades de imagen, ajuste las representaciones de color (LUT) de los diferentes canales en la ventana Ajuste de visualización. Haga clic en Avanzado para establecer manualmente los valores mínimos/máximos y un valor para la corrección gamma.Haga clic en los nombres de los canales para cambiar los nombres y las LUT. Después de ajustar la apariencia de la imagen, exporte la vista actual con la herramienta Instantánea. Utilice el icono Animación para representar los datos 3D como una película. Utilice el puntero de navegación para buscar una perspectiva/vista y zoom y utilice + Añadir para añadir fotogramas clave. Muévase a otra posición y agregue el siguiente fotograma clave. Presione el botón rojo de grabación para crear la película. Guárdelo en la carpeta de destino y el tipo de archivo deseados (Figura 1J).