Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Alle hier beschriebenen Tierversuche sind behördlich bewilligt (Bewilligung 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) und folgen den lokalen Richtlinien (Tierschutz-Verordnung, Basel) und dem Schweizer Tierschutz-Gesetz. 1. Vorbereitung und Lagerung von infiziertem Gewebe Verwenden Sie ein Infektionsmodell Ihrer Wahl. Hier werden 10 bis 16 Wochen alte Mäuse beiderlei Geschlechts mit ~1.000 koloniebildenden Einheiten (KBE) durch intravenöse Injektion oder 5 x 107 KBE durch intragastrische Verabreichung mit einer Rundnadel infiziert. Geeignete Mausstämme sind BALB/c und C57BL/6.HINWEIS: Der gleiche Ansatz kann leicht für andere Wirtsarten angepasst werden. Stellen Sie sicher, dass Krankheitserreger fluoreszierende Proteine exprimieren, um die Identifizierung in ungefärbtem Gewebe zu ermöglichen. Krankheitserreger, die GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 oder mWasabi16 exprimieren, können alle mit 940 nm Anregung17 sichtbar gemacht werden. Salmonellen , die mCherry18 in Konzentrationen exprimieren, die durch Durchflusszytometrie19 leicht nachweisbar sind, konnten mittels 800-nm-Anregung abgebildet werden, weisen jedoch in infizierter Milz und Leber ein schlechtes Signal-Hintergrund-Verhältnis auf, das eine erhebliche Autofluoreszenz aufweist. Stellen Sie sicher, dass alle fluoreszierenden Proteine nach der Fixierung mit Paraformaldehyd bei neutralem pH-Wert auf der Grundlage der Quantifizierung mit Durchflusszytometrie >70 % ihrer Fluoreszenzintensität behalten. Hier wird infiziertes Mausgewebe verwendet, nämlich Milz, Leber, Lymphknoten und Peyer-Pflaster. Färben Sie Oberflächenmarker von Wirtszellen in vivo durch Injektion von Phycoerythrin (PE)-markierten Antikörpern 10 Minuten vor der Perfusion. Um Neutrophile zu färben, injizieren Sie intravenös 4 μg Anti-Ly-6G-PE in 100 μl PBS. Zur Färbung von Marginalzonen-Makrophagen in der Milz injizieren Sie 4 μg Anti-CD169-PE in 100 μl PBS (siehe Materialtabelle). Fixieren Sie infiziertes Gewebe durch standardmäßige transkardiale Perfusion20 mit 15 ml eiskaltem 50 mM Phosphatpuffer (PB; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7,4), gefolgt von 35 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA; Fixiermittel) in PB (Abbildung 1A).Kurz gesagt, verabreichen Sie dem infizierten Tier eine Tiefenanästhesie durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 16 mg/kg Xylazin. Stellen Sie eine ordnungsgemäße Anästhesie sicher, indem Sie den Verlust des Zehenkneifreflexes bestätigen. Desinfizieren Sie das Fell mit 70% Ethanol, trocknen Sie es mit einem sterilen Papiertuch ab und öffnen Sie die Brust chirurgisch mit Pinzette und Schere. Platzieren Sie eine sterile Nadel in der linken Herzkammer, öffnen Sie den rechten Vorhof mit einer sterilen Schere und führen Sie den ersten Puffer und dann das Fixiermittel mit einer Pumpe durch die Nadel, die linke Herzkammer und das gesamte Gefäßsystem. Dadurch werden alle Gewebe schnell und gleichmäßig fixiert und die Euthanasie bewirkt. Entnehmen Sie das Gewebe nach der Perfusion, inkubieren Sie es in einem 20-fachen Volumen von 4 % kaltem Paraformaldehyd in PB-Puffer und legen Sie es über Nacht bei 4 °C auf einen Schüttler (Abbildung 1B). Die Bildgebung ist für Gewebe im Größenbereich von 0,05 bis 2 cmmöglich 3. Für größere Taschentücher in geeignete Stücke schneiden. Am nächsten Tag das Tuch 3x für je 10 min mit PB-Puffer waschen und bei 40 U/min bei Raumtemperatur schütteln, um PFA zu entfernen.HINWEIS: Aufgrund der PFA-Toxizität müssen diese Schritte in einem Abzug durchgeführt werden. Entsorgen Sie die PFA-Abfälle gemäß den institutionellen Richtlinien. Entfernen Sie überschüssigen PB-Puffer und geben Sie das 20-fache Volumen des Kryoprotektivum-Lagerpuffers21 (876 mM Saccharose, 0,25 mM Polyvinylpyrrolidon, 40 % (v/v) Ethylenglykol, gelöst in 50 mM PB-Puffer) in die Probe unter Schütteln bei 40 U/min bei 4 °C für 6-8 h oder bis das Gewebe auf den Boden sinkt. Die Proben werden mindestens 3 Tage lang bei -20 °C inkubiert, um eine wirksame Reduzierung der Gewebeautofluoreszenz zu gewährleisten11. Die Proben können bei einer Lagerung bei -20 °C bis zu 5 Jahre lang verwendet werden.HINWEIS: Das Absinken des Gewebes deutet auf ein ordnungsgemäßes Eindringen des Speicherpuffers in das Gewebe hin. 2. Einbettung von Beispielen Betten Sie das Gewebe in einen Agaroseblock ein, um einen reibungslosen Schnitt mit einem Vibratom zu erzielen. Die Agarose durch Oxidation mit Periodat chemisch voraktivieren und dann mit Borhydrid reduzieren, um eine Vernetzung mit dem Gewebe zu bilden, um die Stabilität während des Schneidprozesses zu verbessern. Führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus. Bereiten Sie 4% oxidierte Agarose vor, indem Sie 2,25 g Agarose wiegen und 0,21 g NaIO4 hinzufügen. Fügen Sie 100 mL PB zu Agarose und NaIO4 hinzu. Bei Raumtemperatur in einem Abzug 2-3 h unter Lichtschutz umrühren.HINWEIS: Kritischer Schritt: Rühren Sie nicht länger als 3 Stunden ein, da die Agarose sonst schlecht polymerisiert. Rückgewinnung der Agarose durch Membranfiltration in einem Standard-Vakuumfilter mit einer 0,2 μm Membran. Entfernen Sie das restliche NaIO4 , indem Sie 3x mit 50 mL PB-Puffer waschen. Die oxidierte Agarose wird in 50 ml PB-Puffer resuspendiert.HINWEIS: Schmelzen Sie die Agarose in dieser Phase nicht. Die Agarose kann bei 4 °C bis zu 2-3 Wochen lichtgeschützt gelagert werden. Bereiten Sie Borhydridlösung vor, indem Sie 19 g Borax und 3 g Borsäure zu 1 l Wasser geben. Rühren, bis es sich aufgelöst hat, und den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 9-9,5 einstellen. Auf einer Rührplatte in einem Abzug 100 ml Boratpuffer auf 40 °C erhitzen. 0,2 g NaBH4 dazugeben und 15-30 min unter Lichtschutz rühren.HINWEIS: Die Borhydridlösung kann mehrere Wochen bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert werden. Kritischer Schritt: Bei der Zugabe von NaBH4 zum Boratpuffer bildet sich Gas, führen Sie diesen Schritt daher in einem Abzug durch. Führen Sie diesen Schritt nicht in einem dicht verschlossenen Behälter durch, da dies zu einer Explosion führen kann. Entnehmen Sie das Gewebe nach ausreichender Inkubation für eine verminderte Autofluoreszenz (≥ 3 Tagen) aus dem Gefrierschrank, entfernen Sie überschüssigen Kryoprotektiva-Lagerpuffer und waschen Sie das Gewebe 3x für jeweils 10 Minuten mit PB-Puffer unter Schütteln bei 40 U/min bei Raumtemperatur (RT). Schmelzen Sie ca. 20 mL oxidierte Agarose-Suspension (hergestellt in Schritt 1) in einer Mikrowelle (700 W für ~30 s), lassen Sie sie so weit abkühlen, dass sie verarbeitet werden kann (~45 °C), und gießen Sie sie in eine Kunststoffform.HINWEIS: Kritischer Schritt: Geben Sie die Agarose nicht direkt nach dem Erhitzen in der Mikrowelle auf die Probe, da dies zur Zerstörung des Gewebes führen kann. Nehmen Sie das Taschentuch mit einer Pinzette vorsichtig auf und führen Sie es schnell in die untere Mitte der Agarose ein. Inkubieren Sie die Form 15 Minuten lang bei RT, damit die Agarose polymerisieren kann. Öffnen Sie nach der Agarosepolymerisation die Kunststoffform mit einem Skalpell von den vier Ecken her und nehmen Sie den Agarosewürfel vorsichtig mit behandschuhten Fingern auf. Die Probe wird 2-3 Stunden lang bei 4 °C in Borhydridlösung (in Schritt 2 hergestellt) getaucht, um die Vernetzung der oxidierten Agarose und des Gewebes einzuleiten. Dadurch wird verhindert, dass sich das Gewebe beim Schneiden ablöst.HINWEIS: Kritischer Schritt: Die in Borhydrid getauchte Probe sollte vor Licht geschützt bei 4 °C inkubiert werden. Den Agarosewürfel 2x mit PB Puffer 10 min waschen. Drehen Sie den Agarosewürfel so, dass sich das Gewebe an der Oberseite befindet und befestigen Sie den Block mit ein paar Tropfen Sekundenkleber an einem Magnetobjektträger (Objektträger mit zwei Magneten, die an der Rückseite befestigt sind). Es dauert 10-20 Minuten, bis sich der Kleber verfestigt hat, legen Sie also ein Papiertuch mit Tropfen PB-Puffer auf die Agarose, um sicherzustellen, dass die Probe durchgehend ausreichend hydratisiert bleibt (Abbildung 1C). 3. Vorbereitung des Mikrotoms und Vorbereitung der Inszenierung Platzieren Sie den magnetischen Objektträger auf dem Metall in der Mitte des Probenkastens des Tomographen. Füllen Sie die Box mit PB-Puffer und positionieren Sie sie vorsichtig auf dem Tisch und ziehen Sie die Schraube links fest, um die Probenbox auf dem Tisch des Tomographen zu befestigen.HINWEIS: Ziehen Sie die Schrauben nicht zu fest an, da sonst die Kunststoffbox beschädigt wird. Legen Sie die Klinge auf das Mikrotom und verschieben Sie die Position der Probe vorsichtig in der Nähe und unter dem Mikrotom. Die Oberseite der Agarose sollte sich auf der gleichen Höhe wie die Klinge des Mikrotoms befinden.HINWEIS: Wenn Sie ihn zu niedrig positionieren, verschwenden Sie Schnittzeit, während bei einer zu hohen Positionierung ein großer Teil des Blocks beim ersten Schnitt entfernt wird. Bewegen Sie den Tisch, um den Agarose-Würfel in der Mitte des Objektivs zu positionieren, und klicken Sie wiederholt auf die Schaltfläche Slice in der Tomograph-Software, bis Sie eine intakte Scheibe des gesamten Agarose-Würfels erhalten. 4. Zuordnung der Oberfläche und Aufnahme von 2D-Bildern Zentrieren Sie die Objektivlinse in x- und y-Richtung auf die Gewebeprobe. Öffnen Sie die Lasersoftware und schalten Sie den Laser in der Software ein. Wenn Sie ein tickendes Geräusch hören, schalten Sie den Laserschalter ein und stellen Sie die Wellenlänge auf 800 nm ein.HINWEIS: Die Laserquelle muss vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten, idealerweise 1 Stunden, aufgewärmt werden. Schließen Sie die Gehäusetüren des Mikroskops, schalten Sie alle Lichtquellen im Raum aus, schalten Sie die PMTs ein und stellen Sie die Spannung auf 750 V ein.HINWEIS: Kritischer Schritt: PMTs sind sehr lichtempfindlich, lassen Sie es ausgeschaltet, es sei denn, die Schranktüren sind geschlossen und alle Lichtquellen im Raum sind ausgeschaltet. Passen Sie die Protokolleinstellungen der Tomographensoftware wie beschrieben an und stellen Sie den Mikroskopverschluss auf automatisch und die Spannung auf 20 bzw. 3 für V1 bzw. V2. Klicken Sie auf die 2D-Schaltfläche in der Tomograph-Software, um einen Schnappschuss der Probe aufzunehmen. Sobald ein Bild mit sichtbarer Autofluoreszenz angezeigt wird, passen Sie den Z-Piezo an, um die Fokusebene auf der Oberfläche des Agarosewürfels festzulegen. Der erste Scan erfolgt 20 μm unter der Oberfläche, um ein stabiles Bild der Probe zu erhalten.Wenn kein Autofluoreszenzhintergrund sichtbar ist, erhöhen Sie den Kontrast, bis ein Signal erscheint. Es kann vorkommen, dass kein sichtbares Signal vorhanden ist (z. B. aufgrund der Agarose auf der Oberseite des Gewebes). Stellen Sie in diesem Fall die z-Achse mit dem z-Piezo Gerät ein, bis sie die Agaroseoberfläche erreicht. Eine manuelle Bewegung der Linse kann erforderlich sein, wenn die gewünschte Position außerhalb des Bereichs des Z-Piezo-Geräts liegt. Schneiden Sie mehrere 50-μm-Scheiben, nachdem Sie die Oberfläche der Probe gefunden haben, und nehmen Sie nach jedem Schnitt 2D-Bilder auf, um sicherzustellen, dass die Fokusebene richtig auf der Oberfläche der Blockfläche ausgerichtet ist. 5. Ermitteln der Kanten der Proben und Einstellen des Lasers auf den Startpunkt Basierend auf den xy-Koordinaten des Laserscanbereichs (4 Eckkoordinaten) beschränken Sie den Bildgebungsbereich auf das Gewebe mit minimaler Bildgebung des umgebenden Agaroseblocks. Schalten Sie die PMTs aus, stellen Sie die Laserwellenlänge auf 800 nm ein und schalten Sie den Laserverschluss auf Öffnen. Die Position des Laserlichts, das in den Agaroseblock eintritt, ist als roter Streulichtfleck sichtbar (Abbildung 2A,B).Kritischer Schritt: Seien Sie besonders vorsichtig mit dem Laser der Klasse 4. Es kann menschliches Gewebe und Augen schnell schädigen. Das Personal benötigt eine spezielle Schulung, um ein solches Instrument sicher bedienen zu können. Verwenden Sie den Laserspot beim Verschieben des Tisches, um die Koordinaten der Geweberänder anhand der Sequenz hinten, rechts, vorne und links zu ermitteln. Überprüfen Sie die Koordinaten und positionieren Sie den Laserpunkt in der rechten vorderen Ecke, die der Standardstartpunkt für die Bildgebung des Gewebes ist. Konvertieren Sie die Koordinaten aus dem Konsolenfenster in maschinenerkennbare Blockgrößen, die durch die xy-Schritte definiert werden. Tragen Sie diese Schrittmessungen in das Protokoll der Software ein. Schließen Sie die Schranktüren. 6. 3D Scannen / Schneiden Ändern Sie die Wellenlänge auf 940 nm, um GFP, mWasabi oder YPet und PE anzuregen.HINWEIS: Der Laser ist für das menschliche Auge bei dieser Wellenlänge unsichtbar. Um das Signal-Hintergrund-Verhältnis für GFP, mWasabi und die grün emittierende Komponente von TIMERbac zu verbessern, platzieren Sie einen schmalbandigen Passfilter 510/20 nm vor PMT 2. Dadurch wird die Interferenz durch grün-gelbe Gewebeautofluoreszenz reduziert. Schalten Sie den Mikroskop-Verschluss in den Automatikmodus und die Verschlussspannung auf 20 für V1 und 1,71 für V2. Stellen Sie die folgenden drei Parameter in der Software ein: Querschnittsdicke – für die meisten Zwecke auf 50 μm eingestellt. Für die Leber auf 30 μm einstellen, da die Bildgebungstiefe begrenzt ist. Die Anzahl der physikalischen Schnitte – dies bestimmt die Gesamtgewebetiefe, die abgebildet wird, und wird entsprechend eingestellt. Die Anzahl der Ebenen, die für jeden Schnitt erfasst werden sollen – dies bestimmt die z-Auflösung. Verwenden Sie für die meisten Zwecke 5 Ebenen (mit einer vertikalen Auflösung von 10 μm). Für die Leber verwenden Sie 3 oder weniger Ebenen. Stellen Sie die Laserverstärkung ein. Dies muss für verschiedene Gewebe und Scantiefen empirisch getestet werden. Definieren Sie den Ordnerpfad und den Namen zum Speichern der erfassten Bilder und geben Sie die entsprechenden Informationen für die Imaging-Metadatei an. Überprüfen Sie alle eingegebenen Werte. Klicken Sie auf 3D-Mosaikeinstellung , um den Scanvorgang zu starten (Abbildung 1D). Entnehmen Sie nach Abschluss der Bildgebung die Gewebeschnitte vorsichtig aus dem Wassertank und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung in einem Lagerpuffer bei -20 °C (Abbildung 1E; Abbildung 2C,D). 7. Bildverarbeitung und Datenanalyse Laden Sie die MATLAB-Skripte von https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020 auf einen Linux-Computer herunter. Kopieren Sie die Skripte in einen Ordner, z. B. /home/user/Program/.HINWEIS: Das Add-on Computer Vision Toolbox für MATLAB und Fidschi (oder ImageJ) muss auf Linux-Computern installiert sein, damit das Skript voll funktionsfähig ist. Fügen Sie Kachelbilder wie unten beschrieben zusammen.Übertragen Sie Daten vom Tomographenserver auf den Linux-Rechner. Öffnen Sie das MATLAB-Skript StepOneStitchingAndArchive.m und suchen Sie den Quellordner mit den Rohdaten. Definieren Sie die Quell- und Zielordner im Skript. Wechseln Sie zur Registerkarte Editor und klicken Sie auf Ausführen. Fortschrittsinformationen werden im Befehlsfenster angezeigt. Die Verarbeitung umfasst das Lesen von Informationen aus der Mosaik-Datei, das Generieren des Kachelindex vor dem Zusammenfügen von Bildern, die Korrektur der Hintergrundbeleuchtung mit Cidre22 (Abbildung 3) sowie die Beleuchtungskorrektur zwischen optischen Schichten, die in unterschiedlicher Tiefe erfasst wurden. Suchen Sie die zusammengefügten Bilder in einem Unterordner namens stitchedImages_100 im Quellordner. Komprimieren Sie die Rohdaten für die langfristige Speicherung mit dem Befehl tar, und speichern Sie sie als einzelne Datei mit der Dateinamenerweiterung tar.bz2 (Abbildung 1F). Führen Sie Modelltraining und Segmentierung mit der Support Vector Machine durch. Um die Support Vector Machine zu trainieren und die Segmentierung durchzuführen, führen Sie die folgenden Schritte aus.HINWEIS: Die zusammengefügten Bilder für jeden der drei Fluoreszenzkanäle werden in 3 Unterordnern (mit den Namen 1, 2 und 3, entsprechend roter, orangefarbener und grüner Fluoreszenz) von stitchedImages_100 gespeichert. Jeder Unterordner enthält alle zusammengefügten Bilder aus demselben Kanal.Zeigen Sie eine Vorschau der zusammengefügten Bilder an. Öffnen Sie ein Bild mit demselben Dateinamen aus jedem Unterordner mit Fiji (oder ImageJ). Führen Sie die drei Kanäle zu einem Farbbild zusammen. Passen Sie die Helligkeit jedes Kanals an, bis klare Signale von Bakterien und Gewebeautofluoreszenz zu sehen sind. Notieren Sie sich die angepasste maximale Intensitätsstufe jedes Kanals für den nächsten Schritt. Öffnen Sie das MATLAB-Skript StepTwoSegmentationAndAnalysis.m, und navigieren Sie zur Quelle. Definieren Sie den Quellordner und die Image-Namen für das Training. Zum BeispielsourceD = ‘/’ ;red_name = [sourceD ‘1/section_020_01.tif’]; green_name = [sourceD ‘2/section_020_01.tif’];blue_name = [QuelleD ‘3/section_020_01.tif’]; Gehen Sie zur Registerkarte Editor und klicken Sie auf Ausführen. Es erscheint ein Dialogfeld, in dem nach Farbschwellenwerten gefragt wird, füllen Sie es basierend auf der vorherigen manuellen Überprüfung mit Fiji (Schritt 7.3.1). Wählen Sie Regionen für den Hintergrund und interessante Bereiche (z. B. Bakterien) gemäß den Dialogfeldern aus. Es werden Diagramme angezeigt, die zeigen, wie gut das Modell trainiert wurde, und gefragt werden, ob weitere Regionen hinzugefügt werden müssen. Fügen Sie weitere Bereiche von Interesse und Hintergrund hinzu, bis die Bakterien eindeutig segmentiert werden können (Abbildung 4A, B). Benennen und speichern Sie das Modell. Das Skript lädt die Bilder automatisch und wendet einen Medianfilter (Radius 2 Pixel) an. Der Segmentierungsprozess wird automatisch ausgeführt, und die Fortschrittsinformationen werden im Befehlsfenster angezeigt. Beobachten Sie den Fortschritt der Segmentierung. Wenn die Segmentierung mit dem Modell bei anderen zusammengefügten Bildern nicht gut funktioniert, wiederholen Sie das Modelltraining, um mehr Hintergrund- und Bakterienregionen einzubeziehen. Um die Ergebnisse der Segmentierung zu sehen, überprüfen Sie die Datei mit dem Namen Allpositions_filter3D.txt. Diese Datei enthält die Koordinaten des Schwerpunkts für jedes Bakterium oder jede bakterielle Mikrokolonie und die entsprechende integrierte Fluoreszenzintensität (Abbildung 1G). Entfernen Sie zusätzliche Artefakte mit Convolutional Neural Network, wie unten beschrieben.HINWEIS: Bei einigen Bakterien enthält die einfache Segmentierung mit der Support Vector Machine immer noch einige Bildgebungsartefakte. Dies gilt insbesondere für YPet-exprimierende Bakterien. Die auf neuronalen Netzen basierende Segmentierung kann diese Artefakte effizient beseitigen (Abbildung 4C). Das Add-on Computer Vision Toolbox für MATLAB und Fidschi (oder ImageJ) muss auf Windows-Computern installiert sein, damit das Skript voll funktionsfähig ist. Informationen zum zugrundeliegenden neuronalen Netz finden Sie unter: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.htmlBereiten Sie die Bilder vor. Konvertieren Sie tif-Dateien in jpg-Dateien mit unterschiedlichen Helligkeitsanpassungen mit Fiji. Identifizieren Sie mit manueller Kuration mindestens 600 Bakterien und 600 Artefakte und sichern Sie zugeschnittene Bilder dieser Objekte in entsprechenden Ordnern. Öffnen Sie das MATLAB-Skript CNNtestV4.m und navigieren Sie zu den Quelldateien, die die Objektbilder aus Schritt 7.4.1 enthalten. Definieren Sie den Image-Ordner für das Training. Zum BeispieldigitDatasetPath = fullfile (‘D:\20200602_CNN’,’fortrainingPixel12Folder2′);Definieren Sie die Anzahl der Bilder für das Training, z. B. numTrainFiles = 600. Gehen Sie zur Registerkarte Editor und klicken Sie auf Ausführen. Nach dem Training wird die CNN-Modelldatei als gregnet1.mat im Quellordner gespeichert. Definieren Sie einen Ordner mit Testbildern. Zum BeispieldigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).Die Ergebnisse werden in einer Datei gespeichert YourFile.txt die Informationen über den Bildnamen und die Klassifizierung als Bakterien oder Artefakt enthält. Definieren Sie einen Ordner mit Testbildern. Zum BeispieldigitDatasetPathTest = fullfile(‘D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).Die Ergebnisse werden in einer Datei YourFile.txt gespeichert, die Informationen über den Bildnamen und die Klassifizierung als Bakterien oder Artefakt enthält. Schätzen Sie die Größe von Mikrokolonien basierend auf der Fluoreszenzintensität einzelner Bakterien, wie unten beschrieben.HINWEIS: Die räumliche Auflösung des Tomographen reicht nicht aus, um einzelne Bakterienzellen innerhalb dicht gepackter Mikrokolonien aufzulösen. Die Anzahl der Bakterien in jeder Mikrokolonie kann jedoch auf der Grundlage der Gesamtfluoreszenz der Mikrokolonie im Verhältnis zur Fluoreszenz einzelner Bakterien geschätzt werden. Diese Schätzgenauigkeit hängt von der Homogenität der Fluoreszenzintensität in der gesamten Bakterienpopulation ab.Bestätigung der Identität von GFP-positiven Ereignissen in der STP-Tomographie durch Färbung bakterieller Bestandteile wie Lipopolysaccharid mittels Immunhistochemie von Schnitten aus dem Tomographen (Abbildung 1H; Abbildung 5). Identifizieren Sie mindestens 30 einzelne Bakterien und ermitteln Sie deren Fluoreszenzintensität aus den entsprechenden Segmentierungsergebnissen. Verwenden Sie den mittleren Intensitätswert als Referenz für ein einzelnes Bakterium. Berechnen Sie die Bakterienzahl jeder Mikrokolonie, indem Sie die Gesamtfluoreszenzintensität der Mikrokolonie durch den Referenzwert für ein einzelnes Bakterium dividieren (Abbildung 1I). Führen Sie eine 3D-Rekonstruktion mit einer Visualisierungssoftware durch, wie unten beschrieben.BildvorbereitungNehmen Sie die Bilder des blauen Kanals, die Signale der zweiten Harmonischen von Kollagen enthalten, die eine nützliche anatomische Referenz darstellen, einschließlich Gewebekapseln, Arterien und Trabekeln. Verwenden Sie Bilder, die nach Bakterien als 2. Kanal segmentiert sind. Ordnen Sie die Bilder aus dem 1. Kanal sowohl in der x- als auch in der y-Achse um das 10-fache ab und speichern Sie die verkleinerten Bilder in einem neuen Ordner. Erstellen Sie 3 Replikate von verkleinerten Bildern im selben Ordner. Der Name neuer Replikate sollte die gleiche Reihenfolge beibehalten. Beispiel: section_001_01.tif replizieren Sie 1 mit dem Namen section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Wenden Sie diese Schritte auch auf die Bilder aus dem 2. Kanal an. Durch die Verkleinerung werden die Dateigrößen besser überschaubar. Die Dreifachbilder glätten die z-Achse. Führen Sie die Bilder aus den einzelnen Kanälen zusammen, um Bildstapel mit Fidschi zu bilden. Klicken Sie auf Bild > Stapel > Tools > Stapelsortierer > Nach Beschriftungen sortieren. Führen Sie eine 3D-Filterung durch. Klicken Sie auf > Filter verarbeiten > 3D-Filter und legen Sie die Z-Filtergröße auf 6 fest. Speichern Sie die Bildstapel. Führen Sie die 3D-Visualisierung wie unten beschrieben durch.Öffnen Sie die Visualisierungssoftware in der Arena-Ansicht (Standardeinstellung). Verwenden Sie das Symbol “Überwachter Ordner”, um Ordner zur Arena-Ansicht hinzuzufügen. Mit einem Doppelklick öffnen Sie die Datei *.ims oder *.tif (vorbereitet in 7.6.1). Passen Sie mit der Option “Bearbeiten>Bildeigenschaften” die Farbdarstellungen (LUTs) der verschiedenen Kanäle im Fenster “Anzeigeanpassung” an. Klicken Sie auf Erweitert , um die Min-/Max-Werte und einen Wert für die Gammakorrektur manuell einzustellen.Klicken Sie auf die Kanalnamen , um die Namen und LUTs zu ändern. Nachdem Sie das Erscheinungsbild des Bildes angepasst haben, exportieren Sie die aktuelle Ansicht mit dem Schnappschuss-Werkzeug. Verwenden Sie das Symbol Animation, um die 3D-Daten als Film darzustellen. Verwenden Sie den Navigationszeiger, um eine Perspektive/Ansicht zu finden, und zoomen Sie und verwenden Sie + Hinzufügen, um Schlüsselbilder hinzuzufügen. Bewegen Sie sich an eine andere Position und fügen Sie den nächsten Keyframe hinzu. Drücken Sie die rote Aufnahmetaste , um den Film zu erstellen. Speichern Sie es im gewünschten Zielordner und Dateityp (Abbildung 1J).