Tomographie tridimensionnelle à haute résolution des infections microbiennes

Toutes les expériences sur les animaux décrites ici ont été approuvées par les autorités (licence 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) et suivent les directives locales (Tierschutz-Verordnung, Bâle) et la loi suisse sur la protection des animaux (Tierschutz-Gesetz). 1. Préparation et conservation des tissus infectés Utilisez le modèle d’infection de votre choix. Ici, des souris âgées de 10 à 16 semaines des deux sexes sont infectées avec ~1 000 unités formant colonies (UFC) par injection intraveineuse ou 5 x 107 UFC par administration intragastrique avec une aiguille à bout rond. Les souches de souris appropriées comprennent BALB/c et C57BL/6.REMARQUE : La même approche peut être facilement adaptée à d’autres espèces hôtes. S’assurer que les agents pathogènes expriment des protéines fluorescentes pour permettre l’identification dans les tissus non colorés. Les agents pathogènes exprimant GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 ou mWasabi16 peuvent tous être visualisés à l’aide d’une excitation de 940 nm17. Les salmonelles exprimant mCherry18 à des niveaux facilement détectables par cytométrie en flux19 ont pu être imagées à l’aide d’une excitation de 800 nm, mais ont de mauvais rapports signal/bruit de fond dans la rate et le foie infectés, qui montrent une autofluorescence substantielle. S’assurer que toutes les protéines fluorescentes conservent >70 % de leur intensité de fluorescence après fixation avec du paraformaldéhyde à pH neutre sur la base de la quantification par cytométrie en flux. Ici, des tissus de souris infectés, à savoir la rate, le foie, les ganglions lymphatiques et les patchs de Peyer, sont utilisés. Colorer les marqueurs de surface de la cellule hôte in vivo en injectant des anticorps marqués à la phycoérythrine (PE) 10 min avant la perfusion. Pour colorer les neutrophiles, injecter par voie intraveineuse 4 μg d’anti-Ly-6G-PE dans 100 μL de PBS. Pour colorer les macrophages de la zone marginale de la rate, injecter 4 μg d’anti-CD169-PE dans 100 μL de PBS (voir le tableau des matériaux). Fixer les tissus infectés par perfusion transcardique standard20 avec 15 mL de tampon phosphate glacé de 50 mM (PB ; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7,4), suivi de 35 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA ; fixateur) dans du PB (figure 1A).En bref, administrer une anesthésie profonde à l’animal infecté par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de kétamine et de 16 mg/kg de xylazine. Assurez-vous d’une anesthésie appropriée en confirmant la perte du réflexe de pincement des orteils. Désinfectez la fourrure avec de l’éthanol à 70 %, séchez-la avec une serviette en papier stérile et ouvrez chirurgicalement la poitrine avec une pince à épiler et des ciseaux. Placez une aiguille stérile dans le ventricule gauche du cœur, ouvrez l’oreillette droite avec des ciseaux stériles, puis faites passer le premier tampon, puis le fixateur à travers l’aiguille, le ventricule gauche et l’ensemble du système vasculaire à l’aide d’une pompe. Cela fixe tous les tissus rapidement et uniformément et provoque l’euthanasie. Prélever le tissu après la perfusion, l’incuber dans un volume de 20 fois de paraformaldéhyde froid à 4 % dans un tampon PB et le placer sur un agitateur à 4 °C pendant la nuit (figure 1B). L’imagerie est possible pour les tissus de 0,05 à 2 cm3. Pour les tissus plus gros, coupez-les en morceaux appropriés. Le lendemain, lavez le mouchoir 3 fois pendant 10 minutes chacun avec un tampon PB en secouant à 40 tr/min à température ambiante pour éliminer le PFA.REMARQUE : En raison de la toxicité PFA, ces étapes doivent être effectuées à l’intérieur d’une hotte. Éliminez les déchets PFA conformément aux directives institutionnelles. Retirer tout excès de tampon PB et ajouter 20 fois le volume de tampon de stockage cryoprotecteur21 (876 mM de saccharose, 0,25 mM de polyvinylpyrrolidone, 40 % (v/v) d’éthylène glycol, dissous dans un tampon de PB de 50 mM) à l’échantillon en agitant à 40 tr/min à 4 °C pendant 6 à 8 h ou jusqu’à ce que les tissus coulent au fond. Incuber les échantillons à -20 °C pendant au moins 3 jours pour assurer une réduction efficace de l’autofluorescence tissulaire11. Les échantillons peuvent être utilisés jusqu’à 5 ans s’ils sont conservés à -20 °C.REMARQUE : L’enfoncement du tissu indique une bonne pénétration du tampon de stockage dans le tissu. 2. Intégration de l’échantillon Incorporez le tissu dans un bloc d’agarose pour une coupe en douceur avec un vibratome. Pré-activer chimiquement l’agarose par oxydation avec du periodate, puis réduire avec du borohydrure pour former une réticulation avec le tissu pour une meilleure stabilité pendant le processus de coupe. Effectuez les étapes décrites ci-dessous. Préparez de l’agarose oxydée à 4 % en pesant 2,25 g d’agarose et ajoutez 0,21 g de NaIO4. Ajouter 100 mL de PB à l’agarose et au NaIO4. Remuer à température ambiante dans une hotte pendant 2-3 h à l’abri de la lumière.REMARQUE : Étape critique : Ne pas dépasser l’agitation pendant plus de 3 h ou l’agarose polymérisera mal. Récupérer l’agarose par filtration membranaire dans un filtre à vide standard avec une membrane de 0,2 μm. Retirez le NaIO4 restant en lavant 3 fois avec 50 ml de tampon PB. Remettre l’agarose oxydée en suspension dans 50 mL de tampon PB.REMARQUE : Ne faites pas fondre l’agarose pendant cette étape. L’agarose peut être conservée à 4 °C jusqu’à 2-3 semaines à l’abri de la lumière. Préparez une solution de borohydrure en ajoutant 19 g de borax et 3 g d’acide borique à 1 L d’eau. Remuer jusqu’à dissolution et ajuster le pH à 9-9,5 avec 1 M de NaOH. Sur une plaque agitatrice dans une hotte, chauffer 100 mL de tampon à borate à 40 °C. Ajouter 0,2 g de NaBH4 et remuer pendant 15-30 min à l’abri de la lumière.REMARQUE : La solution de borohydrure peut être conservée pendant plusieurs semaines à température ambiante dans l’obscurité. Étape critique : Lors de l’ajout de NaBH4 au tampon de borate, du gaz se forme, effectuez donc cette étape à l’intérieur d’une hotte. Ne faites pas cette étape dans un récipient hermétiquement fermé car cela pourrait entraîner une explosion. Sortez les tissus du congélateur après une incubation suffisante pour réduire l’autofluorescence (≥ 3 jours), retirez l’excès de tampon de stockage cryoprotecteur et lavez les tissus 3 fois pendant 10 minutes chacun avec un tampon PB en agitant à 40 tr/min à température ambiante (RT). Faites fondre environ 20 ml de suspension d’agarose oxydée (préparée à l’étape 1) au micro-ondes (700 W pendant ~30 s), laissez-le refroidir suffisamment pour être manipulé (~45 °C) et versez-le dans un moule en plastique.REMARQUE : Étape critique : N’ajoutez pas l’agarose directement après l’avoir chauffé au micro-ondes sur l’échantillon, cela pourrait entraîner la destruction du tissu. À l’aide d’une pince à épiler, prélevez doucement le tissu et insérez-le rapidement dans le centre inférieur de l’agarose. Incuber le moule à RT pendant 15 min pour permettre à l’agarose de polymériser. Après la polymérisation de l’agarose, ouvrez le moule en plastique avec un scalpel par ses quatre coins et ramassez soigneusement le cube d’agarose avec des doigts gantés. Immerger l’échantillon dans une solution de borohydrure (préparée à l’étape 2) pendant 2 à 3 h à 4 °C pour initier la réticulation de l’agarose oxydée et du tissu. Cela empêche le tissu de se détacher lors de la section.REMARQUE : Étape critique : L’échantillon immergé dans le borohydrure doit être incubé à l’abri de la lumière à 4 °C. Lavez le cube d’agarose avec un tampon PB 2x pendant 10 min. Tournez le cube d’agarose de manière à ce que le tissu soit sur la face supérieure et fixez le bloc à une lame magnétique (lame de microscope avec deux aimants fixés à l’arrière) à l’aide de quelques gouttes d’adhésif instantané. Il faut 10 à 20 minutes pour que la colle se solidifie, alors placez un mouchoir en papier avec des gouttes de tampon PB sur l’agarose en veillant à ce que l’échantillon reste suffisamment hydraté tout au long de l’album (Figure 1C). 3. Préparation du microtome et mise en scène Placez la lame magnétique sur le métal au centre de la boîte d’échantillons du tomomètre. Remplissez la boîte avec du tampon PB et positionnez-la soigneusement sur la platine et serrez la vis sur la gauche pour fixer la boîte d’échantillons sur la platine du tomographe.REMARQUE : Ne serrez pas trop les vis, sinon cela endommagerait la boîte en plastique. Placez la lame sur le microtome et déplacez soigneusement la position de l’échantillon près et en dessous du microtome. La surface supérieure de l’agarose doit être au même niveau que la lame du microtome.REMARQUE : Le positionner trop bas fera perdre du temps de coupe, tandis que le positionner trop haut enlèvera une grande partie du bloc lors de la première coupe. Déplacez la platine pour positionner le cube d’agarose au centre de l’objectif et cliquez à plusieurs reprises sur le bouton Slice dans le logiciel de tomographie jusqu’à ce que vous obteniez une tranche intacte du cube d’agarose entier. 4. Attribution de la surface et acquisition d’images 2D Centrez la lentille de l’objectif sur l’échantillon de tissu dans les directions x et y. Ouvrez le logiciel laser et allumez le laser dans le logiciel. Lorsque vous entendez un tic-tac, allumez l’interrupteur laser et ajustez la longueur d’onde à 800 nm.REMARQUE : La source laser doit être chauffée pendant au moins 30 min, idéalement 1 h, avant l’imagerie. Fermez les portes de l’armoire du microscope, éteignez toutes les sources lumineuses de la pièce, allumez les PMT et réglez la tension sur 750 V.REMARQUE : Étape critique : Les PMT sont très sensibles à la lumière, gardez-les éteints à moins que les portes de l’armoire ne soient fermées et que toutes les sources de lumière de la pièce soient éteintes. Ajustez les paramètres de protocole du logiciel du tomographe comme indiqué et réglez l’obturateur du microscope sur automatique et la tension sur 20 et 3 pour V1 et V2, respectivement. Cliquez sur le bouton 2D dans le logiciel de tomographie pour capturer une capture de l’échantillon. Une fois qu’une image avec une autofluorescence visible apparaît, ajustez le piézo z pour définir le plan focal sur la surface du cube d’agarose. Le premier balayage se fera à 20 μm sous la surface pour acquérir une image stable de l’échantillon.Si aucun arrière-plan d’autofluorescence n’est visible, augmentez le contraste jusqu’à ce qu’un signal apparaisse. Il peut arriver qu’il n’y ait pas de signal visible (c’est-à-dire à cause de l’agarose sur le dessus du tissu). Dans ce cas, ajustez l’axe z à l’aide de l’appareil z-piezo jusqu’à ce qu’il atteigne la surface de l’agarose. Un mouvement manuel de l’objectif peut être nécessaire si la position souhaitée est en dehors de la portée de l’appareil z-piezo. Coupez plusieurs tranches de 50 μm après avoir trouvé la surface de l’échantillon et acquérez des images 2D après chaque coupe pour vous assurer que le plan focal est correctement défini sur la surface de la face du bloc. 5. Trouver les bords des échantillons et régler le laser sur le point de départ Sur la base des coordonnées xy de la zone de balayage laser (4 coordonnées d’angle), confinez la zone d’imagerie au tissu avec une imagerie minimale du bloc d’agarose environnant. Éteignez les PMT, réglez la longueur d’onde du laser sur 800 nm, basculez l’obturateur laser sur l’ouverture. La position de la lumière laser entrant dans le bloc d’agarose est visible sous la forme d’un point rouge de lumière diffusée (Figure 2A,B).Étape critique : Soyez particulièrement prudent avec le laser de classe 4. Il peut rapidement endommager les tissus humains et les yeux. Le personnel a besoin d’une formation spéciale pour utiliser un tel instrument en toute sécurité. Utilisez le spot laser tout en déplaçant la platine pour trouver les coordonnées des bords des tissus à l’aide de la séquence arrière, droite, avant et gauche. Vérifiez les coordonnées et positionnez le point laser dans le coin avant droit, qui est le point de départ par défaut pour l’imagerie du tissu. Convertissez les coordonnées de la fenêtre de la console en tailles de bloc reconnaissables par la machine, qui sont définies par les pas xy. Entrez ces mesures d’étape dans le protocole du logiciel. Fermez les portes de l’armoire. 6. 3D numérisation / sectionnement Changez la longueur d’onde à 940 nm pour exciter GFP, mWasabi ou YPet et PE.REMARQUE : Le laser est invisible à l’œil humain à cette longueur d’onde. Pour améliorer le rapport signal/bruit de fond pour GFP, mWasabi et la composante émettrice verte de TIMERbac, placez un filtre passe-bande étroite de 510/20 nm devant PMT 2. Cela réduit l’interférence par l’autofluorescence des tissus vert-jaune. Basculez l’obturateur du microscope en mode automatique et les réglages de tension d’obturation sur 20 pour V1 et 1,71 pour V2. Ajustez les trois paramètres suivants dans le logiciel : Épaisseur de la section – pour la plupart des usages, réglée sur 50 μm. Pour le foie, régler à 30 μm en raison de la profondeur d’imagerie limitée. Le nombre de coupes physiques – cela détermine la profondeur totale du tissu qui sera imagée, réglée en conséquence. Le nombre de plans à capturer pour chaque section déterminera la résolution z. Utilisez 5 plans (offrant une résolution verticale de 10 μm) pour la plupart des usages. Pour le foie, utilisez 3 plans ou moins. Réglez le gain laser. Cela doit être testé empiriquement pour différents tissus et profondeurs de balayage. Définissez le chemin d’accès et le nom du dossier pour le stockage des images acquises et fournissez les informations appropriées pour le métafichier d’imagerie. Vérifiez toutes les valeurs saisies. Cliquez sur le paramètre de mosaïque 3D pour lancer le processus de numérisation (Figure 1D). Une fois l’imagerie terminée, prélever soigneusement les coupes de tissu dans le réservoir d’eau et les conserver dans un tampon de stockage à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées (figure 1E ; Figures 2C, D). 7. Traitement d’images et analyse de données Téléchargez les scripts MATLAB sur un ordinateur Linux à partir de https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020. Copiez les scripts dans un dossier, par exemple /home/user/Program/.REMARQUE : l’add-on Computer Vision Toolbox pour MATLAB et Fiji (ou ImageJ) doit être installé sur des ordinateurs Linux pour que le script soit entièrement fonctionnel. Brodez les images de tuiles comme décrit ci-dessous.Transférez les données du serveur de tomographe vers l’ordinateur Linux. Ouvrez le script MATLAB StepOneStitchingAndArchive.m et localisez le dossier source contenant les données brutes. Définissez les dossiers source et destination dans le script. Passez à l’onglet Editeur et cliquez sur Exécuter. Les informations de progression s’affichent dans la fenêtre de commande. Le traitement comprend la lecture des informations du fichier Mosaic, la génération de l’index des tuiles avant l’assemblage de l’image, la correction de l’éclairage d’arrière-plan avec Cidre22 (Figure 3) ainsi que la correction de l’éclairage entre les couches optiques acquises à différentes profondeurs. Recherchez les images assemblées dans un sous-dossier appelé stitchedImages_100 dans le dossier source. Compressez les données brutes pour un stockage à long terme à l’aide de la commande tar et enregistrez-les en tant que fichier unique avec l’extension de nom de fichier tar.bz2 (Figure 1F). Effectuez l’entraînement et la segmentation du modèle avec une machine à vecteurs de support. Pour entraîner la machine à vecteurs de support et effectuer la segmentation, suivez les étapes ci-dessous.REMARQUE : Les images assemblées pour chacun des trois canaux de fluorescence sont stockées dans 3 sous-dossiers (nommés 1, 2 et 3, correspondant à la fluorescence rouge, orange et verte) de stitchedImages_100. Chaque sous-dossier contient toutes les images assemblées du même canal.Prévisualisez les images assemblées. Ouvrez une image avec le même nom de fichier à partir de chaque sous-dossier avec Fiji (ou ImageJ). Fusionnez les trois canaux en une seule image couleur. Ajustez la luminosité de chaque canal jusqu’à ce que des signaux clairs soient visibles provenant de bactéries et d’autofluorescence tissulaire. Notez le niveau d’intensité maximal ajusté de chaque canal pour l’étape suivante. Ouvrez le script MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m et accédez à source. Définissez le dossier source et les noms des images pour l’entraînement. Par exemplesourceD = ‘/’ ;red_name = [sourceD ‘1/section_020_01.tif’] ; green_name = [sourceD ‘2/section_020_01.tif’] ;blue_name = [sourceD ‘3/section_020_01.tif’] ; Allez dans l’onglet Éditeur et cliquez sur Exécuter. Une boîte de dialogue demandant des seuils de couleur apparaîtra, remplissez-la en fonction de la vérification manuelle précédente avec Fidji (étape 7.3.1). Sélectionnez les régions pour l’arrière-plan et les régions d’intérêt (c’est-à-dire les bactéries) en fonction des boîtes de dialogue. Des graphiques s’affichent pour montrer la qualité de l’entraînement du modèle et demander si d’autres régions doivent être ajoutées. Ajoutez d’autres régions d’intérêt et de fond jusqu’à ce que les bactéries puissent être clairement segmentées (Figure 4A,B). Nommez et enregistrez le modèle. Le script chargera automatiquement les images et appliquera un filtre médian (rayon 2 pixels). Le processus de segmentation s’exécute automatiquement et les informations de progression s’affichent dans la fenêtre de commande. Surveillez l’avancement de la segmentation. Si la segmentation ne fonctionne pas correctement avec le modèle sur d’autres images assemblées, répétez l’entraînement du modèle pour inclure davantage de régions d’arrière-plan et bactériennes. Pour voir les résultats de la segmentation, vérifiez le fichier nommé Allpositions_filter3D.txt. Ce fichier contient les coordonnées du centre de gravité de chaque bactérie ou microcolonie bactérienne et l’intensité de fluorescence intégrée correspondante (Figure 1G). Supprimez les artefacts supplémentaires à l’aide du réseau neuronal convolutif comme décrit ci-dessous.REMARQUE : Pour certaines bactéries, une simple segmentation avec la machine à vecteurs de support inclut encore certains artefacts d’imagerie. Cela est particulièrement vrai pour les bactéries exprimant YPet. La segmentation basée sur les réseaux neuronaux peut supprimer efficacement ces artefacts (Figure 4C). Le module complémentaire Computer Vision Toolbox pour MATLAB et Fiji (ou ImageJ) doit être installé sur les ordinateurs Windows pour que le script soit entièrement fonctionnel. Pour plus d’informations sur le réseau neuronal sous-jacent, consultez : https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.htmlPréparez les images. Convertissez des fichiers tif en fichiers jpg avec différents réglages de luminosité à l’aide de Fidji. Identifiez à l’aide d’une sélection manuelle au moins 600 bactéries et 600 artefacts, ainsi que des images recadrées en toute sécurité de ces objets dans des dossiers appropriés. Ouvrez le script MATLAB CNNtestV4.m et naviguez jusqu’aux fichiers sources contenant les images d’objet de l’étape 7.4.1. Définissez le dossier d’images pour l’entraînement. Par exempledigitDatasetPath = fullfile (‘D :\20200602_CNN’,’fortrainingPixel12Folder2′) ;Définissez le nombre d’images pour l’entraînement, par exemple, numTrainFiles = 600. Allez dans l’onglet Éditeur et cliquez sur Exécuter. Après l’entraînement, le fichier du modèle CNN est enregistré sous le nom gregnet1.mat dans le dossier source. Définissez un dossier avec des images de test. Par exempledigitDatasetPathTest = fullfile(‘D :\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).Les résultats sont enregistrés dans un fichier YourFile.txt qui contient des informations sur le nom de l’image et la classification en tant que bactéries ou artefacts. Définissez le dossier avec des images de test. Par exempledigitDatasetPathTest = fullfile(‘D :\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp’).Les résultats seront enregistrés dans un fichier YourFile.txt, qui contient des informations sur le nom de l’image et la classification en tant que bactérie ou artefact. Estimez la taille des microcolonies en fonction de l’intensité de fluorescence d’une seule bactérie, comme décrit ci-dessous.REMARQUE : La résolution spatiale du tomographe est insuffisante pour résoudre les cellules bactériennes individuelles au sein de microcolonies densément tassées. Cependant, le nombre de bactéries dans chaque microcolonie peut être estimé sur la base de la fluorescence totale de la microcolonie par rapport à la fluorescence d’une seule bactérie. Cette précision d’estimation dépend de l’homogénéité de l’intensité de la fluorescence dans la population bactérienne.Confirmer l’identité des événements positifs à la GFP dans la tomographie STP en colorant les composants bactériens tels que le lipopolysaccharide à l’aide de l’immunohistochimie de coupes récupérées du tomographe (Figure 1H ; Figure 5). Identifiez au moins 30 bactéries uniques et récupérez leur intensité de fluorescence à partir des résultats de segmentation correspondants. Utiliser la valeur d’intensité médiane comme référence pour une seule bactérie. Calculez le nombre de bactéries de chaque microcolonie en divisant l’intensité de fluorescence totale de la microcolonie par la valeur de référence d’une seule bactérie (figure 1I). Effectuez une reconstruction 3D à l’aide d’un logiciel de visualisation comme décrit ci-dessous.Préparation de l’imagePrenez les images du canal bleu, qui contiennent des signaux de deuxième harmonique de collagène fournissant une référence anatomique utile, y compris les capsules de tissus, les artères et les trabécules. Utilisez des images segmentées pour les bactéries comme 2ème canal. Rangez les images du 1ercanal 10 fois sur les axes x et y et enregistrez les images réduites dans un nouveau dossier. Faites 3 répliques d’images réduites dans le même dossier. Le nom des nouvelles réplicats doit conserver la même séquence. Par exemple : section_001_01.tif, répliquez 1 avec le nom section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Appliquez également ces étapes aux images du 2èmecanal. La réduction des tailles permet d’obtenir des tailles de fichiers plus gérables. Les images triples vont lisser l’axe z. Fusionnez les images de chaque canal pour former des piles d’images avec Fidji. Cliquez sur Piles > d’images > Outils > Trieur d’empilements > Trier par étiquettes. Effectuez un filtrage 3D. Cliquez sur Traiter les filtres > > Filtre 3D et définissez la taille du filtre Z sur 6. Enregistrez les piles d’images. Effectuez une visualisation 3D comme décrit ci-dessous.Ouvrez le progiciel de visualisation dans la vue Arena (paramètre par défaut). Utilisez l’icône du dossier de surveillance pour ajouter des dossiers à la vue Arena. Double-cliquez pour ouvrir le fichier *.ims ou *.tif (préparé dans la version 7.6.1). À l’aide de l’option Modifier>Propriétés de l’image, ajustez les représentations des couleurs (LUT) des différents canaux dans la fenêtre de réglage de l’affichage. Cliquez sur Avancé pour régler manuellement les valeurs min/max et une valeur pour la correction gamma.Cliquez sur les noms des canaux pour modifier les noms et les LUT. Après avoir ajusté l’apparence de l’image, exportez la vue actuelle à l’aide de l’outil Instantané. Utilisez l’icône Animation pour représenter les données 3D sous la forme d’un film. Utilisez le pointeur de navigation pour trouver une perspective/vue et zoomer et utilisez + Ajouter pour ajouter des images clés. Déplacez-vous vers une autre position et ajoutez l’image clé suivante. Appuyez sur le bouton d’enregistrement rouge pour construire le film. Enregistrez-le dans le dossier de destination et le type de fichier souhaités (Figure 1J).