سير عمل شبه آلي للحفظ بالتبريد للحيوانات المنوية المرجانية لدعم البنوك الحيوية وتربية الأحياء المائية
Summary
يصف هذا البروتوكول مسارا شبه آلي لتحسين كفاءة وقدرة معالجة المنوية من الأنواع المرجانية المهددة بالانقراض وحفظها بالتبريد ، بهدف تأمين التنوع الجيني ودعم جهود استعادة الشعاب المرجانية.
Abstract
تواجه الشعاب المرجانية أزمة مع زيادة تواتر أحداث التبييض الناجمة عن ارتفاع درجة حرارة المحيطات ، مما يؤدي إلى موت الشعاب المرجانية على الشعاب المرجانية في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي الفقدان اللاحق للتنوع الجيني والتنوع البيولوجي إلى تقليل قدرة المرجان على التكيف مع المناخ المتغير ، لذا فإن الجهود المبذولة للحفاظ على التنوع الحالي ضرورية لتعظيم الموارد المتاحة لاستعادة الشعاب المرجانية الآن وفي المستقبل. النهج الأكثر فعالية لتأمين علم الوراثة على المدى الطويل هو الحفظ بالتبريد والبنوك الحيوية ، والذي يسمح بالتخزين المجمد للعينات الحية في درجات حرارة مبردة في النيتروجين السائل إلى أجل غير مسمى. أصبح حفظ المنوية المرجانية بالتبريد ممكنا منذ عام 2012 ، لكن الطبيعة الموسمية للتكاثر المرجاني تعني أن أنشطة البنوك الحيوية تقتصر على بضع ليال فقط في السنة عند حدوث التبويض. لذلك فإن تحسين كفاءة معالجة المنوية المرجانية وسير عمل الحفظ بالتبريد أمر ضروري لتعظيم فرص البنوك الحيوية المحدودة هذه. تحقيقا لهذه الغاية ، شرعنا في تحسين مسارات معالجة الحفظ بالتبريد للحيوانات المنوية المرجانية من خلال البناء على التقنيات الحالية وإنشاء نهج شبه آلي لتبسيط تقييم المنوية المرجانية والتعامل معها وحفظها بالتبريد. هذه العملية ، التي تجمع بين تحليل المنوية بمساعدة الكمبيوتر ، و cryovials المشفرة ، وسلسلة من أوراق البيانات التلقائية المرتبطة للتحرير المتزامن من قبل العديد من المستخدمين ، تعمل على تحسين كفاءة كل من معالجة العينات وإدارة البيانات الوصفية في هذا المجال. من خلال التكامل مع برامج البحوث الشاملة مثل برنامج استعادة الشعاب المرجانية والتكيف معها في أستراليا ، يمكن أن يلعب الحفظ بالتبريد دورا حاسما في برامج استعادة الشعاب المرجانية على نطاق واسع من خلال تسهيل الإدارة الوراثية لمجموعات تربية الأحياء المائية ، ودعم البحوث لتعزيز التسامح الحراري ، ومنع انقراض الأنواع المرجانية. وستستخدم الإجراءات الموصوفة لممارسي حفظ المرجان بالتبريد والبنوك الحيوية في الشعاب المرجانية في جميع أنحاء العالم، وستوفر نموذجا لانتقال تكنولوجيات الحفظ بالتبريد من مختبرات البحوث إلى التطبيقات واسعة النطاق.
Introduction
تعاني الشعاب المرجانية على مستوى العالم من فقدان الأنواع المرجانية والسكان والتنوع الجيني بسبب ارتفاع درجة حرارة المحيطات وتحمضها الناجم عن تغير المناخ ، مما يقلل من صلاحية هذه الموائل الحرجة ويؤثر على الأنواع التي تدعمها 1,2. النهج الأكثر فعالية لتأمين علم الوراثة على المدى الطويل هو الحفظ بالتبريد والبنوك الحيوية ، والذي يسمح بالتخزين المجمد للعينات الحية في درجات حرارة مبردة في النيتروجين السائل إلى أجل غير مسمى3. مكن تطوير طرق الحفظ بالتبريد للحيوانات المنوية المرجانية4 في عام 2012 من البنوك الحيوية لعلم الوراثة من هذه الأنواع لأول مرة وأدى إلى تطوير أول مستودع حيوي لعلم الوراثة المرجانية في عام 20125. منذ ذلك الحين ، تم تحسين بروتوكول الحفظ بالتبريدهذا 6 واستخدامه لتأمين علم الوراثة لأكثر من 50 نوعا من المرجان على مستوى العالم ، مع 30 من هذه الأنواع القادمة من الحاجز المرجاني العظيم في أستراليا7. يمكن للحيوانات المنوية المرجانية المحفوظة بالتبريد أن تولد شعاب مرجانية صحية تتطور بشكل طبيعي وقد استخدمت لتسهيل تجارب تدفق الجينات المساعدة في أستراليا8 ومنطقة البحر الكاريبي9. في حين أن التقنيات قيد التطوير حاليا لتمكين الحفظ بالتبريد لأنواع الأنسجة المعقدة مثل اليرقات10 والأنسجة المرجانية البالغة11،12 ، فإن الحفظ بالتبريد للحيوانات المنوية المرجانية هو حاليا الأداة الأكثر انتشارا المتاحة للبنوك الحيوية الروتينية لعلم الوراثة المرجانية.
مع زيادة التأثيرات على مجموعات الشعاب المرجانية ، بدأت العديد من البلدان برامج واسعة النطاق لدعم استعادة الشعاب المرجانية والتكيف معها (على سبيل المثال ، برنامج استعادة الشعاب المرجانية والتكيف معها [RRAP] في أستراليا13) أو لتأمين مجموعات المرجان المتبقية المعرضة للخطر (على سبيل المثال ، فلوريدا كورال ريسكيو في الولايات المتحدة الأمريكية14). في سياق هذه البرامج ، يمكن اعتبار الحفظ بالتبريد بمثابة تقنية تمكينية ، تدعم البحث وإنتاج المرجان على نطاق واسع بالإضافة إلى تأمين التنوع الجيني الحالي ومنع الانقراض. يمكن أن يتيح حفظ المنوية بالتبريد تحكما أكبر في التكاثر بين المجموعات المنفصلة جسديا أو زمنيا ويمكن أن يسمح للإدارة الوراثية لقطعان التفريخ باختيار السمات المرغوبة مثل التحمل الحراري أو مقاومة الأمراض8. حتى الآن، تم إجراء البنوك الحيوية للحيوانات المنوية المرجانية على نطاق صغير نسبيا لدعم إدارة التنوع البيولوجي7، لذلك ستكون هناك حاجة إلى مستوى معين من الترقية إذا كان لهذا البنك الحيوي أن يلبي إمكاناته ضمن برامج استعادة الشعاب المرجانية الأكبر هذه. كما هو الحال مع جميع جهود استعادة الشعاب المرجانية القائمة على تكاثر الشعاب المرجانية ، فإن العائق الرئيسي أمام زيادة جهود البنوك الحيوية هو الفترة المحدودة التي تتوفر خلالها الأمشاج المرجانية ، حيث يتزامن التفريخ في معظم أنواع بناء الشعاب المرجانية مع اكتمال القمر في أواخر الربيع وأوائلالصيف 15 ، مما يعني أن الأمشاج متاحة فقط للحفظ بالتبريد والبنوك الحيوية في بضع ليال كل عام. علاوة على ذلك ، في المناطق التي يحدث فيها التفريخ الجماعي ، على سبيل المثال ، الحاجز المرجاني العظيم ، هناك عادة أنواع متعددة تبيض في وقت واحد أو في غضون ساعات قليلة من بعضها البعض في نفس الليلة15. لذلك يلزم إدخال تحسينات على مسار حفظ المنوية بالتبريد لزيادة حجم وكفاءة المعالجة لزيادة قدرة البنوك الحيوية إلى أقصى حد خلال نوافذ التفريخ السنوية القصيرة هذه مع ضمان سلامة العينات والبيانات الوصفية المرتبطة بها.
يتضمن الحفظ بالتبريد والبنوك الحيوية للحيوانات المنوية المرجانية عدة خطوات رئيسية ، من جمع الأمشاج أثناء التفريخ إلى انضمام العينات إلى المستودع الحيوي وقاعدة البيانات (الشكل 1). تبدأ العملية بفصل المنوية عن البويضات (في الأنواع الخنثى) أو جمع المنوية من عمود الماء (في الأنواع الخنثى) ، يليها تقييم حركة المنوية وتركيزها. ثم يتم دمج المنوية مع مادة واقية من البرد (10٪ v / v التركيز النهائي ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO) في مياه البحر المفلترة (FSW) وتبريدها عند -20 درجة مئوية / دقيقة في جهاز تبريد مصمم خصيصا4. اعتمدت التكرارات المبكرة لهذه العملية على التقييم البصري لحركة المنوية وتركيزها عبر الفحص المجهري على النقيض من الطور وعدد مقياس الدم ، والطباعة ، وأنابيب وضع العلامات حيث تمت معالجة العينات للحفظ بالتبريد ، وسحب عينات المنوية يدويا إلى cryovials ، والتبريد على رف عائم مصمم خصيصا16. أدى تطبيق تحليل المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA)17 وتطوير جهاز تبريد مطبوع ثلاثي الأبعاد6 إلى تحسين كفاءة وموثوقية حفظ المنوية بالتبريد ، لكن مسار معالجة عينات المنوية ظل كما هو إلى حد كبير منذ إنشائه. في حين أن هذا النهج مناسب لمعالجة العينات من عدد معتدل من المستعمرات والأنواع في ليلة التفريخ ، بالنسبة للكميات الكبيرة وأعداد المستعمرات (على سبيل المثال ، العينات الفردية من >10 مستعمرات في المرة الواحدة) ، هناك اختناقات في مسار الحفظ بالتبريد تعيق معالجة العينات في الوقت المناسب (أي في غضون 2 ساعة من إطلاق المنوية) دون تدهور إمكانات خصوبة العينة. على الرغم من توفر أنظمة معالجة السوائل على نطاق واسع للكريوفيال (على سبيل المثال ، Thomas et al.18) ، إلا أنها مصممة عادة لمعالجة الدفعات الكبيرة (أي رفوف متعددة من cryovials) وليست مناسبة للنقل والاستخدام في الميدان ، لذلك فهي ليست فعالة من حيث التكلفة لهذا التطبيق. لذلك ، تهدف الدراسة الحالية إلى تحسين كفاءة حفظ المنوية المرجانية بالتبريد من خلال إدخال معدات وطرق أتمتة محمولة وغير مكلفة في الخطوات الرئيسية في مسار المعالجة لزيادة عدد العينات التي يمكن حفظها بالتبريد بشكل فعال في ليلة التفريخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح مسار المعالجة شبه الآلي الموصوف في هذا البروتوكول بالمعالجة الفعالة والحفظ بالتبريد للحيوانات المنوية المرجانية لتأمين علم الوراثة من الأنواع المهددة بالانقراض ودعم جهود استعادة الشعاب المرجانية والتكيف معها. كان الدافع وراء تطوير هذا البروتوكول هو عدم وجود أنظمة قائمة مناسبة لمتطلبات الإنتاجية لحفظ المنوية المرجانية بالتبريد واستخدام cryovials ، حيث أن أنظمة المعالجة عالية الإنتاجية لحفظ المنوية بالتبريد تعتمد عادة على تغليف العينات في 0.25 مل أو 0.5 مل من القش الفرنسي21,22. وبالمقارنة ، تستخدم المبردات بشكل عام إما على نطاق صغير للمعالجة منخفضة الإنتاجية (على سبيل المثال ، الحفظ بالتبريد للعينات المختبرية للبحث23،24) ، أو في أنظمة المعالجة عالية الإنتاجية للعينات السائبة باستخدام معدات باهظة الثمن وغير محمولة (على سبيل المثال ، معالجة زراعة الخلايا للصناعة18،25). لقد حققنا أيضا في إمكانية استخدام نظام الفك التلقائي لتبسيط إزالة واستبدال أغطية التبريد ، لكن الأنظمة كانت متاحة فقط لأجهزة التبريد الفردية أو للرفوف المبردة بأكملها ، لذلك لم توفر حلا فعالا من حيث التكلفة. حاليا ، هناك العديد من المجموعات على مستوى العالم التي تستخدم بروتوكول الحفظ بالتبريد الذي ابتكره Hagedorn et al.4 لتأمين التنوع الجيني للشعاب المرجانية ، ومن المهم أن يستمر هذا العمل في التوسع ليشمل المزيد من الشعاب المرجانية في جميع أنحاء العالم. ولذلك، كان أحد الاعتبارات الرئيسية في وضع البروتوكول الحالي هو الحاجة إلى استخدام تكنولوجيات فعالة من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليها والتي يمكن تنفيذها بسهولة من قبل هذه المجموعات الأخرى، والتي لن تكون باهظة التكلفة بالنسبة للمجموعات الجديدة الراغبة في البدء في حفظ المنوية المرجانية بالتبريد.
يتمثل أحد المكونات الرئيسية للبروتوكول الموصوف في المعالجة المحسنة لعينة بيانات التعريف عبر جداول البيانات المرتبطة في Microsoft Excel. يعد إدخال البيانات واضحا بشكل عام ، ولكن يجب ملاحظة أن تحرير المعلومات في أوراق البيانات التلقائية يجب أن يتم فقط عن طريق حذف المعلومات وإعادة إدخالها ، حيث من المحتمل أن تؤثر الوظائف السريعة (على سبيل المثال ، Ctrl + C ، Ctrl + V) لتحرير البيانات على المدخلات المتزامنة من قبل المستخدمين الآخرين ويمكن أن تسبب مشاكل في ربط البيانات بين جداول البيانات. أحد مكونات البيانات الوصفية المهمة هو معرف فريد (أي معرف مستعمرة) مرتبط بمستعمرة المتبرع ويتم إرفاقه بالعينة في جميع مراحل مسار المعالجة. من الضروري أن يتم تمييز أنابيب العينة بوضوح بمعرف المستعمرة في وقت جمع الحزمة ، وأن يتم نسخ هذه المعلومات بدقة على أي أنابيب جديدة يتم نقل العينة إليها أثناء التحضير (على سبيل المثال ، أثناء التصفية لفصل البويضات المنوية ، أو للإضافة المخففة بالتبريد). على الرغم من أن البروتوكول يتيح النقل التلقائي لمعلومات جودة العينة من مشغل CASA إلى محطة عمل الحفظ بالتبريد ، إلا أنه يمكن مواجهة مشكلات عندما تكون تغطية الإنترنت أو Wi-Fi ضعيفة. في حالة مواجهة تأخيرات في نقل البيانات ، يوصى بأن تعمل محطتا العمل دون اتصال بالإنترنت وأن تحتفظا بأوراق بيانات تلقائية منفصلة يمكن التوفيق بينها بعد ذلك. المعلومات الأساسية المطلوبة من قبل مشغل الحفظ بالتبريد هي معرف المستعمرة وتركيز العينة ، لذلك يوصى بأن يكتب مشغل CASA تركيز العينة على أنبوب العينة كنسخة احتياطية لضمان أن هذه المعلومات في متناول اليد لإعداد الحفظ بالتبريد إذا كان هناك تأخير في تحميل أو تنزيل البيانات الوصفية بين أجهزة الكمبيوتر.
يمكن أن يختلف اختيار ماسح الباركود والمبردات المشفرة المستخدمة لهذا البروتوكول لتناسب الميزانية وتوافر المنتج ؛ ومع ذلك ، هناك بعض العناصر الرئيسية التي ينبغي مراعاتها في اختيارهم. يجب أن يكون لماسح الباركود القدرة على الإعدادات المخصصة ، وتحديدا القدرة على تغيير مواصفات إدخال البيانات واتجاه إدخال البيانات. تستخدم أوراق البيانات التلقائية المستخدمة لهذا البروتوكول الإدخال الأفقي ، ولكن في بعض المناسبات (على سبيل المثال ، الانضمام إلى البنك الحيوي أو للاستخدامات المختبرية الأخرى) قد يكون الدخول الرأسي مطلوبا ، لذلك من المهم أن تكون هذه الميزة قابلة للتخصيص. بينما يمكن استخدام البروتوكول مع كل من الرموز الشريطية 1D و 2D ، يوصى بأن تحتوي cryovials المختارة على مكون يمكن قراءته من قبل الإنسان (على سبيل المثال ، تتضمن الرموز الشريطية 1D عادة رقما فريدا) للسماح بالتحقق من إدخال العينة أثناء الحفظ بالتبريد. بالإضافة إلى إدخال العينة ، يمكن استخدام ماسح الباركود لأتمتة إدخال بعض حقول البيانات الوصفية عن طريق إنشاء وطباعة رموز QR للمعلومات التي تتكرر عبر العينات (مثل أسماء الأنواع والتواريخ ومواقع الشعاب المرجانية) قبل التفريخ. يمكن بعد ذلك إدخال هذه المعلومات بسرعة وسهولة في أوراق البيانات التلقائية عن طريق المسح الضوئي باستخدام ماسح الباركود. علاوة على ذلك ، من خلال إرفاق الرموز الشريطية للرقم التسلسلي بكل رف تبريد ومسبار مزدوج حراري ، من الممكن أيضا ربط كل عملية حفظ بالتبريد بمجموعة محددة من المعدات داخل قاعدة البيانات ، وهو أمر مفيد لمراقبة الجودة وتحديد المكونات التي تتطلب الإصلاح أو الاستبدال.
غالبا ما تكون العوامل المحددة في المعالجة هي الوقت الذي تقضيه في انتظار تفكك الحزم والوقت اللازم لتصفية المنوية وفصلها عن البويضات قبل CASA والحفظ بالتبريد. حيثما أمكن ، يوصى بمعالجة العينات بالترتيب الذي تتفكك به الحزم ؛ ومع ذلك ، يمكن تحقيق المزيد من المكاسب في الكفاءة من خلال الإدارة الاستراتيجية لأوامر معالجة العينات. على سبيل المثال ، إذا كان هناك 5 أو أقل من cryovials لكل مستعمرة بسبب انخفاض أحجام العينات (أي أقل من 3 مل من المنوية لكل مستعمرة) أو انخفاض تركيز المنوية الذي يتطلب تخفيفا بنسبة 2: 1 مع مادة مخففة بالتبريد (أي أقل من 2 × 109 / مل) ، فمن الأفضل إضافة مادة مخففة بالتبريد إلى عينتين مستعمرتين في نفس الوقت بحيث يمكن تشغيلهما معا على نفس رف التبريد (إجمالي # فتحات متاحة = 11) ، بدلا من تشغيلها بشكل منفصل مع الدمى التي تملأ المساحات الفارغة. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن تشغيل رفوف تبريد متعددة في وقت واحد (للعينات >حجم 6 مل) بشرط توخي الحذر لضمان إمكانية إكمال جميع العمليات في غضون 10 دقائق من وقت توازن المبرد المخفف بالتبريد ، مما قد يزيد من إنتاجية العينة. ومع ذلك ، عند تشغيل رفوف تبريد متعددة أو الجمع بين مستعمرات متعددة على رف تبريد واحد ، يجب توخي الحذر لضمان تعيين البيانات الوصفية للحفظ بالتبريد للعينة الصحيحة في ورقة البيانات التلقائية ، خاصة إذا تم حفظ العينات بالتبريد بترتيب مختلف عن تقييم CASA الخاص بهم.
بالإضافة إلى تطوير سير العمل شبه الآلي ، يوفر وصف البروتوكول الحالي أيضا مقارنتين منهجيتين تتعلقان بتركيز المنوية التي تهدف إلى تحسين تحليل المنوية ونتائج الحفظ بالتبريد. بشكل عام ، سيؤدي جمع 5 مل من حزم الأمشاج التي تزيد عن 5 مل من مياه البحر (الحجم الإجمالي 10 مل) إلى تركيز المنوية عند أو أعلى من 2 × 109 خلايا / مل ، ولكن هناك مناسبات قد يكون فيها تركيز المنوية أقل بسبب اختلافات الأنواع أو تفكك الحزم أثناء التجميع. يقلل استخدام مادة DMSO المخففة بالتبريد ذات التركيز العالي (30٪ v / v) من الكمية التي يتم بها تخفيف المنوية للمساعدة في تقليل التباين من دفعة إلى أخرى في تركيز المنوية في cryovial. والأهم من ذلك، أن استخدام 30٪ DMSO لتحقيق تركيز DMSO النهائي لا يؤثر على تركيز ما بعد الذوبان أو معلمات الحركة، كما هو موضح في البيانات التمثيلية في الشكل 3. توفر المقارنة المنهجية الثانية بديلا لشرائح غرفة الغطاء الثابت ذات الاستخدام الواحد المستخدمة عادة في CASA. يتمثل التحدي الرئيسي في استخدام الشرائح المتاحة تجاريا لتحليل المنوية المرجانية في أنها يمكن أن تؤثر على دقة تقييم الحركة بسبب التصاق المنوية بطلاء الشريحة. يتغلب استخدام حل التنشيط على هذه المشكلة في العديد من العينات وليس كلها ، لذلك لا يزال يوصى بإجراء تحليل CASA منفصل للحركة باستخدام شريحة عادية لضمان الموثوقية والاتساق. يتغلب استخدام غرفة عد Makler على الحاجة إلى تحليل التركيز والحركة بشكل منفصل ، ومن المحتمل أن يحسن دقة قياسات التركيز (الشكل 2) ، لذلك يوصى باستخدامه مع البروتوكول الحالي. بالنظر إلى هذا التناقض في قياسات التركيز ، وهي نتيجة تم الإبلاغ عنها سابقا20 ، من المهم دائما تسجيل تفاصيل الشريحة في قاعدة البيانات جنبا إلى جنب مع بيانات جودة المنوية ، وحيثما أمكن ، أن تكون متسقة في نوع شريحة الغرفة المستخدمة لتقليل التباين من دفعة إلى أخرى والمساعدة في ضمان حسابات موثوقة للحيوانات المنوية: نسب البويضات للإخصاب.
توفر العملية شبه الآلية الموصوفة هنا مسارا موحدا وفعالا للحفظ بالتبريد والبنوك الحيوية للحيوانات المنوية من الأنواع المرجانية المهددة مع الحفاظ على الأمن الحيوي للعينة وجودتها. البروتوكول الموصوف قابل للنقل بسهولة وغير مكلف نسبيا للتنفيذ في البرامج في جميع أنحاء العالم التي تعمل على تأمين التنوع المرجاني الحالي باستخدام الحفظ بالتبريد ، والذي سيكون ضروريا لمنع الانقراض وتعظيم الموارد المتاحة لجهود استعادة الشعاب المرجانية الآن وفي المستقبل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المالكين التقليديين لكونومي ، شعب Woppaburra ، على الإذن بتجربة النظام الموصوف في هذه الورقة أثناء التفريخ داخل البلد في نوفمبر 2022 ، ومركز Konomie للتعليم البيئي لاستخدام مرافقهم. ونود أيضا أن نعرب عن تقديرنا للدعم المقدم من موظفي المعهد الأسترالي للعلوم البحرية والعلماء الذين يسروا جمع وتفريخ المستعمرات داخل جهاز محاكاة البحر الوطني. تم تنفيذ هذا العمل كنشاط للبرنامج الفرعي للحفظ بالتبريد (RRAP-CP-01) لبرنامج استعادة الشعاب المرجانية والتكيف معها ، وهي شراكة بين Reef Trust التابع للحكومة الأسترالية ، ومؤسسة Great Barrier Reef Foundation ، بدعم إضافي من Taronga Conservation Society Australia ، ومبادرة Taronga Conservation Science وغيرها من المحسنين الذين يدعمون مؤسسة Taronga.
Materials
| Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller – Aliquotting pipette | Vistalab | 2100-1005 | Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials |
| 5 mL serological pipettes (bulk) | Thermo Scientific | Nunc 170355 | Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials |
| 10 mL serological pipettes (bulk) | Thermo Scientific | Nunc 170356 | Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials |
| P2 0.2–2 µL pipettor | Gilson | F144054M | Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment |
| P10 1–10 µL pipettor | Gilson | F144055M | Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment |
| P20 2–20 µL pipettor | Gilson | F144056M | Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment |
| P200 20–200 µL pipettor | Gilson | F144058M | Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment |
| P1000 100–1000 µL pipettor | Gilson | F144059M | Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment |
| Vacuum pump | Millipore | WP6122050 | Preparation of filtered sea water for solution preparation |
| Reusable bottle-top filtration system | Thermo Scientific | DS0320-5045 | Preparation of filtered sea water for solution preparation |
| 0.22-µm filter discs, mixed cellulose esters | Merck Millipore | GSWP04700 | Preparation of filtered sea water for solution preparation |
| Filtered sea water | N/A | – | Base medium for sperm activation and cryoprotectant solutions |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Cryoprotectant chemical used at a final concentration of 10% v/v in filtered seawater for sperm cryopreservation |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | Used to activate sperm motility |
| BSA heat shock fraction | Sigma-Aldrich | A9647 | Used to minimise sperm adherance to CASA well slides |
| 15-mL tubes – racked | Thermo Scientific | 339651 | Preparation of sperm activation solution |
| 50-mL tubes racked | Thermo Scientific | 339653 | For collection of gamete bundles and filtered sperm samples |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | Samco 202PK | To aid collection of gamete bundles from the water surface |
| 100-µm filter baskets | Fisher Scientific | 22363549 | To exclude eggs during separation of the sperm sample |
| Eppendorf racks | Interpath | 511029 | Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment |
| Eppendorf 1.5-mL tube | Eppendorf | 30120086 | Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment |
| Glass coverslips 18×18 mm | Brand | 4700 45 | Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy |
| Plain glass slides, precleaned, 75×25 mm | Corning | 2947 | Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy |
| CASA slides (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B) | IMV Technologies | 025107 | Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) |
| Makler sperm counting chamber (CASA) | IVFStore | SM-373 | Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) |
| accu-bead® counting beads | Hamilton-Thorne | 710111 | Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) |
| CASA system + laptop | Hamilton Thorne | Ceros II | Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) |
| Safety Glasses | Generic | – | Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen |
| Lab coat | Long sleeve, full length | – | Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen |
| Cryogloves (pair) | Tempshield | Mid-Arm | Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen |
| Medium forceps | Generic | – | For removing cryopreserved samples from the cryo racks and manipulating samples in liquid nitrogen |
| Barcode scanner (2D compatible) | Zebra | DS2278 | For reading 1D and 2D barcodes on cryovials for sample management |
| 2.0-mL CryoStorage Vial, external thread, pre-capped, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), linear and human readable | Eppendorf | 30079434 | Barcoded cryovials for cryopreservation of sperm samples |
| Cryovial rack | Simport | T315 | Rack to hold cryovials, with locking base to allow for one hand de-capping and capping |
| Freezing racks | Custom | – | Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
| Freezing rack lid | Custom | – | Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
| Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container | Isosteel | VA-9683 | Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
| Lab timers | Generic | – | For timing of cryoprotectant equilibration prior to cryopreservation |
| Nitrogen bath 9L | BelArt | M16807-9104 | For quenching samples during cryopreservaton and holding samples during sorting and handling |
| Thermocouple data logger- multichannel | Omega | HH520 | Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point |
| Thermocouple probe – Type K | Omega | 5SC-TT-K-30-36 | Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point |
| Cryo pens/coloured permanent pen | Staedtler Lumocolor | 318 | Optional for marking cryovial lids to assist with sample management |
| Dry Shipper – charged | Taylor Wharton | CXR100, or CX500 | For transfer of cryopreserved samples from field/collection sites to the biorepository for storage |
References
- Eakin, C. M., Sweatman, H. P. A., Brainard, R. E. The 2014-2017 global-scale coral bleaching event: Insights and impacts. Coral Reefs. 38 (4), 539-545 (2019).
- Anthony, K., et al. New interventions are needed to save coral reefs. Nature Ecology & Evolution. 1 (10), 1-3 (2017).
- Wildt, D. E. Genome resource banking for wildlife research, management, and conservation. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 41 (4), 228-234 (2000).
- Hagedorn, M., et al. Preserving and using germplasm and dissociated embryonic cells for conserving Caribbean and Pacific coral. PLoS ONE. 7 (3), e33354 (2012).
- Hagedorn, M., et al. First frozen repository for the Great Barrier Reef coral created. Cryobiology. 65 (2), 157-158 (2012).
- Zuchowicz, N., Daly, J., Lager, C., Williamson, O., Hagedorn, M. Freezing on the beach: A robust coral sperm cryopreservation design. Cryobiology. 101, 135-139 (2021).
- Hobbs, R. J., et al. A decade of coral biobanking science in Australia – transitioning into applied reef restoration. Frontiers in Marine Science. , 9 (2022).
- Daly, J., et al. Cryopreservation can assist gene flow on the Great Barrier Reef. Coral Reefs. 41, 455-462 (2022).
- Hagedorn, M., et al. Assisted gene flow using cryopreserved sperm in critically endangered coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (38), e2110559118 (2021).
- Daly, J., et al. Successful cryopreservation of coral larvae using vitrification and laser warming. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
- Daly, J., et al. The first proof of concept demonstration of nanowarming in coral tissue. Advanced Sustainable Systems. , (2023).
- Powell-Palm, M. J., et al. Cryopreservation and revival of Hawaiian stony corals via isochoric vitrification. Nature Communications. 14, 4859 (2023).
- . Reef Restoration and Adaptation Program Available from: https://gbrrestoration.org (2023)
- . Florida Coral Rescue Available from: https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue (2023)
- Harrison, P. L. . Coral reefs: An ecosystem in transition. , 59-85 (2011).
- Hagedorn, M., Carter, V. L. Cryobiology: Principles, species conservation and benefits for coral reefs. Reproduction, Fertility and Development. 28 (8), 1049 (2016).
- Zuchowicz, N., et al. Assessing coral sperm motility. Scientific Reports. 11, 61 (2021).
- Thomas, D. Evaluation of an automated cryovial dispensing system for cell banking. Genetic Engineering & Biotechnology News. 37 (17), 22-23 (2017).
- . Coral cryopreservation training course Available from: https://nationalzoo.si.edu/center-for-species-survival/coral-cryopreservation-training-course (2023)
- Bailey, E., et al. Validation of sperm counting methods using limits of agreement. Journal of Andrology. 28 (3), 364-373 (2007).
- Hu, E., Yang, H., Tiersch, T. R. High-throughput cryopreservation of spermatozoa of blue catfish (Ictalurus furcatus): Establishment of an approach for commercial-scale processing. Cryobiology. 62 (1), 74-82 (2011).
- Pickett, B. W., Berndtson, W. E. Preservation of bovine spermatozoa by freezing in straws: A review. Journal of Dairy Science. 57 (11), 1287-1308 (1974).
- Westbrook, C. E., Daly, J., Bowen, B., Hagedorn, M. Cryopreservation of the collector urchin embryo, Tripneustes gratilla. Cryobiology. 15, 104865 (2024).
- Maria, A. N., et al. Use of cryotubes for the cryopreservation of Tambaqui fish semen (Colossoma macropomum). Cryobiology. 70 (2), 109-114 (2015).
- Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreservation & Biobanking. 21 (1), 106-110 (2023).
