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Biology

Ein halbautomatischer Workflow für die Kryokonservierung von Korallenspermien zur Unterstützung von Biobanking und Aquakultur

Published: June 07, 2024
doi:
10.3791/66233
, , , ,
1Taronga Institute of Science and Learning,Taronga Conservation Society Australia, 2School of Biological, Earth and Environmental Sciences,University of New South Wales, 3Department of Mechanical Engineering,University of Minnesota, 4Hawaii Institute of Marine Biology,University of Hawaii, 5Smithsonian National Zoo and Conservation Biology Institute

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Weg zur Verbesserung der Effizienz und Kapazität der Verarbeitung und Kryokonservierung von Spermien bedrohter Korallenarten, mit dem Ziel, die genetische Vielfalt zu sichern und die Bemühungen zur Wiederherstellung von Riffen zu unterstützen.

Abstract

Die Korallenriffe stehen vor einer Krise, da die Häufigkeit von Bleichereignissen, die durch die Erwärmung der Ozeane verursacht werden, zunimmt und zum Absterben von Korallen an Riffen auf der ganzen Welt führt. Der daraus resultierende Verlust der genetischen Vielfalt und der Artenvielfalt kann die Fähigkeit der Korallen, sich an das sich ändernde Klima anzupassen, verringern, daher sind Bemühungen zur Erhaltung der vorhandenen Vielfalt unerlässlich, um die für die Wiederherstellung der Riffe verfügbaren Ressourcen jetzt und in Zukunft zu maximieren. Der effektivste Ansatz, um die Genetik langfristig zu sichern, ist die Kryokonservierung und das Biobanking, das die Lagerung lebender Proben bei kryogenen Temperaturen in flüssigem Stickstoff auf unbestimmte Zeit ermöglicht. Die Kryokonservierung von Korallenspermien ist seit 2012 möglich, aber die saisonale Natur der Korallenvermehrung bedeutet, dass die Biobank-Aktivitäten auf nur wenige Nächte pro Jahr beschränkt sind, wenn das Laichen stattfindet. Die Verbesserung der Effizienz der Arbeitsabläufe bei der Verarbeitung von Korallenspermien und der Kryokonservierung ist daher unerlässlich, um diese begrenzten Biobanking-Möglichkeiten zu maximieren. Zu diesem Zweck haben wir uns zum Ziel gesetzt, die Verarbeitungswege für die Kryokonservierung von Korallenspermien zu optimieren, indem wir auf bestehenden Technologien aufbauen und einen halbautomatischen Ansatz entwickeln, um die Bewertung, Handhabung und Kryokonservierung von Korallenspermien zu rationalisieren. Das Verfahren, das computergestützte Spermienanalysen, barcodierte Kryoröhrchen und eine Reihe von verknüpften automatischen Datenblättern für die gleichzeitige Bearbeitung durch mehrere Benutzer kombiniert, verbessert die Effizienz sowohl der Probenverarbeitung als auch des Metadatenmanagements vor Ort. Durch die Integration mit bereichsübergreifenden Forschungsprogrammen wie dem Reef Restoration and Adaptation Program in Australien kann die Kryokonservierung eine entscheidende Rolle in groß angelegten Programmen zur Wiederherstellung von Riffen spielen, indem sie das genetische Management von Aquakulturpopulationen erleichtert, die Forschung zur Verbesserung der thermischen Toleranz unterstützt und das Aussterben von Korallenarten verhindert. Die beschriebenen Verfahren werden für die Kryokonservierung von Korallen und Biobanking-Praktiker an Riffen weltweit eingesetzt und bieten ein Modell für den Übergang von Kryokonservierungstechnologien von Forschungslabors zu großtechnischen Anwendungen.

Introduction

Korallenriffe erleben weltweit einen Verlust an Korallenarten, Populationen und genetischer Vielfalt aufgrund der durch den Klimawandel verursachten Erwärmung und Versauerung der Ozeane, was die Lebensfähigkeit dieser kritischen Lebensräume verringert und sich auf die Arten auswirkt, die sie beherbergen 1,2. Der effektivste Ansatz zur langfristigen Sicherung der Genetik ist die Kryokonservierung und das Biobanking, das die gefrorene Lagerung von lebenden Proben bei kryogenen Temperaturen in flüssigem Stickstoff auf unbestimmte Zeit ermöglicht3. Die Entwicklung von Methoden zur Kryokonservierung von Korallenspermien4 im Jahr 2012 ermöglichte erstmals das Biobanking von Genetik dieser Arten und führte 2012 zur Entwicklung des ersten Biorepositoriums für Korallengenetik5. Seitdem wurde dieses Kryokonservierungsprotokoll weiter verfeinert6 und verwendet, um die Genetik von über 50 Korallenarten weltweit zu sichern, von denen 30 aus dem Great Barrier Reef in Australien stammen7. Kryokonserviertes Korallensperma kann gesunde Korallen erzeugen, die sich normal entwickeln und zur Erleichterung von Experimenten mit assistiertem Genflussin Australien 8 und der Karibik verwendet wurden9. Während sich derzeit Technologien in der Entwicklung befinden, um die Kryokonservierung komplexer Gewebetypen wie Larven10 und adulter Korallengewebe 11,12 zu ermöglichen, ist die Kryokonservierung von Korallenspermien derzeit das etablierteste verfügbare Instrument für das routinemäßige Biobanking von Korallengenetik.

Da die Auswirkungen auf die Korallenpopulationen zugenommen haben, haben mehrere Länder groß angelegte Programme zur Unterstützung der Wiederherstellung und Anpassung von Riffen (z. B. das Reef Restoration and Adaptation Program [RRAP] in Australien13) oder zur Sicherung verbliebener gefährdeter Korallenpopulationen (z. B. Florida Coral Rescue in den USA14) ins Leben gerufen. Im Rahmen dieser Programme kann die Kryokonservierung als eine Basistechnologie betrachtet werden, die die Forschung und die großflächige Korallenproduktion unterstützt und die vorhandene genetische Vielfalt sichert und das Aussterben verhindert. Die Kryokonservierung von Spermien kann eine bessere Kontrolle über die Fortpflanzung zwischen Populationen ermöglichen, die physisch oder zeitlich getrennt sind, und kann das genetische Management von Brutbeständen ermöglichen, um nach wünschenswerten Merkmalen wie thermischer Toleranz oder Krankheitsresistenz zu selektieren8. Bisher wurde das Biobanking von Korallenspermien in relativ kleinem Maßstab zur Unterstützung des Biodiversitätsmanagementsdurchgeführt 7, so dass ein gewisses Maß an Upscaling erforderlich sein wird, wenn ein solches Biobanking sein Potenzial im Rahmen dieser größeren Programme zur Wiederherstellung von Riffen ausschöpfen soll. Wie bei allen Bemühungen zur Wiederherstellung von Riffen, die auf der Fortpflanzung von Korallen basieren, ist das Haupthindernis für die Ausweitung der Biobanking-Bemühungen der begrenzte Zeitraum, in dem Korallengameten verfügbar sind, da das Laichen bei den meisten riffbildenden Arten mit dem Vollmond im späten Frühjahr und Frühsommer zusammenfällt15, was bedeutet, dass Gameten nur an wenigen Nächten im Jahr für die Kryokonservierung und Biobanking zur Verfügung stehen. Darüber hinaus gibt es in Regionen, in denen Massenlaichen stattfindet, wie z. B. am Great Barrier Reef, in der Regel mehrere Arten, die gleichzeitig oder innerhalb weniger Stunden in derselben Nachtlaichen. Daher sind Verbesserungen des Kryokonservierungswegs von Spermien erforderlich, um den Umfang und die Effizienz der Verarbeitung zu erhöhen und die Biobankkapazität während dieser kurzen jährlichen Laichfenster zu maximieren und gleichzeitig die Integrität der Proben und der zugehörigen Metadaten zu gewährleisten.

Die Kryokonservierung und das Biobanking von Korallenspermien umfassen mehrere wichtige Schritte, von der Entnahme der Gameten während des Laichens bis hin zum Zugang der Proben in das Biorepository und die Datenbank (Abbildung 1). Der Prozess beginnt mit der Trennung der Spermien von den Eizellen (bei hermaphroditischen Arten) oder der Entnahme von Spermien aus der Wassersäule (bei gonochorischen Arten), gefolgt von der Beurteilung der Beweglichkeit und Konzentration der Spermien. Die Spermien werden dann mit einem Kryoprotektivum (10 % v/v Endkonzentration, Dimethylsulfoxid, DMSO) in gefiltertem Meerwasser (FSW) kombiniert und in einem speziell entwickelten Kühlgerät auf -20 °C/min gekühlt4. Frühe Iterationen dieses Prozesses beruhten auf der visuellen Beurteilung der Beweglichkeit und Konzentration der Spermien mittels Phasenkontrastmikroskopie und Hämozytometerzählungen, dem Drucken und Markieren von Röhrchen bei der Verarbeitung von Proben für die Kryokonservierung, dem manuellen Pipettieren von Spermien in Kryofläschchen und dem Abkühlen auf einem speziell konstruierten schwimmenden Gestell16. Die Anwendung der computergestützten Spermienanalyse (CASA)17 und die Entwicklung eines 3D-gedruckten Kühlgeräts6 haben die Effizienz und Zuverlässigkeit der Kryokonservierung von Korallenspermien verbessert, aber der Weg der Verarbeitung von Spermien ist seit seiner Einführung weitgehend gleich geblieben. Während dieser Ansatz für die Verarbeitung von Proben aus einer moderaten Anzahl von Kolonien und Arten in einer Laichnacht geeignet ist, gibt es bei großen Volumina und einer großen Anzahl von Kolonien (z. B. Einzelproben von >10 Kolonien gleichzeitig) Engpässe im Kryokonservierungsweg, die eine rechtzeitige Verarbeitung der Proben (d. h. innerhalb von 2 Stunden nach der Spermienfreisetzung) behindern, ohne das Fruchtbarkeitspotenzial der Probe zu beeinträchtigen. Obwohl groß angelegte Fluid-Handling-Systeme für Kryofläschchen verfügbar sind (z. B. Thomas et al.18), sind sie in der Regel für die Verarbeitung großer Chargen (d. h. mehrere Racks mit Kryofläschchen) ausgelegt und nicht für den Transport und den Einsatz im Feld geeignet, so dass sie für diese Anwendung nicht kosteneffizient sind. Daher zielte die vorliegende Studie darauf ab, die Effizienz der Kryokonservierung von Korallenspermien zu verbessern, indem tragbare, kostengünstige Automatisierungsgeräte und -methoden in Schlüsselschritten des Verarbeitungsprozesses eingeführt wurden, um die Anzahl der Proben zu maximieren, die in einer Laichnacht effektiv kryokonserviert werden können.

Protocol

Die hierin beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um Spermien sowohl von hermaphroditischen als auch von gonochorischen Korallenarten zu verarbeiten und zu kryokonservieren. Eine allgemeine Einführung und Einführung in das Laichen von Korallen und die Entnahme von Gameten für die Kryokonservierung von Spermien für beide Fortpflanzungsmodi finden Sie im Coral Cryopreservation Training Course19 des Smithsonian’s National Zoo & Conservation Biology Institute. Die beschriebenen Methoden wurden hauptsächlich unter Verwendung von Gameten aus Acropora millepora-Kolonien entwickelt, die von der Keppel Island-Gruppe im Woppaburra Sea Country und vom Davies Reef im Bindal Sea Country am Great Barrier Reef in Australien gesammelt wurden. Alle Entnahmen und Verwendungen von Korallen und Gameten wurden mit der freien, vorherigen und informierten Zustimmung der traditionellen Hüter der betreffenden Meeresländer durchgeführt. Die für diese Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Vor dem Laichen – Systemkontrollen und Vorbereitung der Spermienaktivierungslösung und des Kryoverdünnungsmittels Vergewissern Sie sich, dass der Barcode-Scanner aufgeladen und aktiv ist und so eingestellt ist, dass Tabellenkalkulationsdaten als horizontale Zelleneingabe eingegeben werden. Konsultieren Sie das Benutzerhandbuch des Barcode-Lesegeräts, um diese Einstellung anzupassen. Bereiten Sie konzentrierte Stammlösungen für die Aktivierung von Korallenspermien für CASA vor.HINWEIS: Beim Umgang mit Chemikalien zur Herstellung der Aktivierungslösung sollten Einweghandschuhe getragen werden.30%ige Stammlösung aus Rinderserumalbumin (BSA) (5 ml) herstellen, indem 1,5 g BSA in 4 ml sterilem gereinigtem Gewebekulturwasser mit Hilfe eines auf 37 °C eingestellten Röhrchenwärmers gelöst werden oder indem das Röhrchen in hohlen Händen gehalten wird, wobei das Röhrchen regelmäßig leicht geschwenkt wird (Durchstechflasche darf nicht geschüttelt werden). Sobald es in Lösung ist, füllen Sie es mit Gewebekulturwasser auf das endgültige Volumen (5 ml) auf, beschriften Sie das Röhrchen mit dem Datum und markieren Sie “30% BSA in H2O”. Im Kühlschrank (4 °C) bis zu 2 Wochen lagern. Bereiten Sie 60 mM Koffein-Stammlösung (25 mL) vor, indem Sie 0,2913 g Koffein in 24 mL gefiltertem Meerwasser (FSW) auflösen. Sobald es in Lösung ist, füllen Sie es mit FSW auf das endgültige Volumen (25 ml) auf, beschriften Sie das Röhrchen mit dem Datum und markieren Sie “60 mM Koffein in FSW”. Bis zu 1 Monat im Kühlschrank aufbewahren.HINWEIS: Die maximale Löslichkeit von Koffein in FSW beträgt ca. 71 mM. Bereiten Sie eine Arbeitslösung zur Spermienaktivierung für Spermienproben bei ~109 Spermien/ml (0,9 % BSA + 12 mM Koffein in FSW) vor.Für 10 ml Arbeitslösung kombinieren Sie 2,0 ml 60 mM Koffein-Stammlösung + 0,3 ml 30%ige BSA-Stammlösung + 7,7 ml FSW. Beschriften Sie die Tube mit dem Datum und “Spermienaktivierung wirkende Lösung – 0,9% BSA + 12 mM Koffein”. Bereiten Sie die Zubereitung an jedem Tag der Anwendung vor, lagern Sie sie bei Raumtemperatur (19-30 °C) und entsorgen Sie die nicht verwendete Lösung am Ende des Tages. Bereiten Sie Kryoprotektiva (Kryoverdünnungsmittel) vor. Stellen Sie sicher, dass beim Umgang mit dem Kryoprotektivum DMSO Einweghandschuhe getragen werden.HINWEIS: FSW wird mit unterschiedlichen Kryoprotektiva-Konzentrationen hergestellt, abhängig von der anfänglichen Spermienkonzentration in einer Probe und der gewünschten endgültigen Spermienkonzentration von kryokonservierten Aliquoten. Bei der Vorbereitung des Kryoverdünnungsmittels ist darauf zu achten, dass FSW vor der Zugabe von DMSO in das 50-ml-Röhrchen aliquotiert wird.Sammeln Sie rohes Meerwasser aus dem Tanksystem, in dem die Korallen vor dem Laichen gehalten werden (~35 ppt Salzgehalt). Filtrieren Sie das rohe Meerwasser mit einem Flaschenfiltersystem, das an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist, an der ein pyrogener 0,2-μm-Membranfilter angebracht ist. Für eine Spermienkonzentration ≥2 × 109 Spermien/ml bereiten Sie 20 % DMSO in FSW vor, indem Sie 10 ml DMSO + 40 ml FSW in einem 50-ml-Röhrchen kombinieren. Für eine Spermienkonzentration <2 × 109 Spermien/ml bereiten Sie 30 % DMSO in FSW vor, indem Sie 15 ml DMSO + 35 ml FSW in einem 50 ml-Röhrchen kombinieren. Beschriften Sie das Röhrchen mit dem Datum und der DMSO-Konzentration, d. h. 30 % DMSO oder 20 % DMSO. Bereiten Sie die Zubereitung an jedem Tag der Anwendung vor, lagern Sie sie bei Raumtemperatur (19-30 °C) und entsorgen Sie die nicht verwendete Lösung am Ende eines jeden Tages.HINWEIS: Das Mischen von DMSO und FSW führt zu einer exothermen Reaktion, und das Kryoverdünnungsmittel sollte rechtzeitig vor der Verwendung hergestellt werden, um eine Abkühlung auf Raumtemperatur zu ermöglichen. FSW kann bei 4 °C zur Vorbereitung des Kryoverdünnungsmittels gelagert werden, um diese Wärmeentwicklung auszugleichen. Thermoelement-Datenlogger vorbereiten.Um die ungefähre Abkühlgeschwindigkeit jedes Kryokonservierungslaufs zu messen, platzieren Sie ein Kryoröhrchen mit 10 % DMSO in FSW mit einer Thermoelementsonde, die durch den Deckel eingeführt wird, in einem Probenschlitz des Kryokonservierungsracks neben den Spermienproben. Um ein Thermoelementfläschchen herzustellen, stechen oder schmelzen Sie ein kleines Loch in die Kappe des Kryofläschchens mit Barcode und führen Sie ein Thermoelement vom Typ K oder T durch die Öffnung ein. Schieben Sie die Sondenspitze des Thermoelements so weit nach unten, dass sie beim Befüllen des Fläschchens in der Mitte der Probe sitzt, und halten Sie die Sondenspitze zentriert im Fläschchen, um einen Kontakt mit der Innenwand des Fläschchens zu vermeiden. Verschließen Sie die Kappe und halten Sie die Thermoelementsonde mit Heißkleber fest. Befüllen Sie das Kryofläschchen mit Barcode mit Einweghandschuhen mit einem Volumen von 10 % DMSO in FSW, das dem Volumen der zu kryokonservierenden Spermienprobe entspricht. Bereiten Sie frisches 10% DMSO in FSW zu und füllen Sie die Thermoelementfläschchen täglich nach. 2. Aufbereitung und Beurteilung von Spermien Bei hermaphroditischen Spezies (z. B. Acropora-Arten ) sammeln Sie Gametenbündel von der Wasseroberfläche mit einer 3-ml-Transferpipette und geben Sie sie in ein markiertes 50-ml-Röhrchen in einem Verhältnis von 5 mL Gametenbündeln über 5 mL Meerwasser (10 mL Gesamtvolumen). Bei gonochorischen Spezies entnehmen Sie mit einer 3-ml-Transferpipette Spermien aus der Nähe des Polypenmunds und geben Sie die Probe in ein beschriftetes 50-ml-Röhrchen, dann fahren Sie direkt mit Schritt 2.8 fort.HINWEIS: Einweghandschuhe sind für die Entnahme und Handhabung von Gametenproben nicht erforderlich, können aber auf Wunsch getragen werden. Die Hände sollten gründlich mit frischem Wasser gewaschen oder die Handschuhe zwischen den einzelnen Gametenproben gewechselt werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Bei hermaphroditischen Arten rühren Sie die Samen-Ei-Bündel um, indem Sie die Probe vorsichtig mit der Hand schwenken, bis die Bündel auseinandergebrochen sind.HINWEIS: Einige Montipora-Arten haben ein Toxin in den Eiern, daher müssen sie langsam und mit minimaler Bewegung zerfallen, um eine Beschädigung der Spermien zu vermeiden. Lassen Sie die Probe 2 Minuten lang in einem Röhrchengestell ruhen, damit die Eizellen an die Oberfläche schwimmen und sich die Spermien absetzen können (die Eizellen bilden eine rosa/braune Schicht an der Oberfläche und einzelne Eizellen sind sichtbar; siehe Abbildung 1i). Um die Spermien zu trennen und kontaminierende Eizellen zu entfernen, saugen Sie das Sperma vorsichtig mit einer sauberen 3-ml-Transferpipette vom Boden des Röhrchens ab. Übertragen Sie die Spermienprobe in ein 100-μm-Zellsieb, das auf einem neuen sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen sitzt. Die Probe sollte leicht durch den Filter fließen. Klopfen Sie auf den Filter, um den Probenfluss zu fördern, und bei Bedarf kann eine saubere Transferpipette verwendet werden, um Restproben von der Unterseite des Filters zu sammeln. Entfernen Sie den Filter und verschließen Sie den Schlauch locker, um den Luftaustausch zu ermöglichen. Beschriften Sie die gefilterte Spermienprobe mit der Kolonie-ID und bringen Sie die Probe zur Spermienbewertungsstation. Öffnen Sie die Datei mit dem automatischen Datenblatt für das Korallenbiobanking (Ergänzende Datei 1). Geben Sie auf der Registerkarte “Spermienbewertung” die Metadaten der Korallenkolonie ein (Spalten A-H). Bereiten Sie die Spermien für die CASA-Bewertung vor.Mischen Sie die Samenprobe gut und entnehmen Sie ein 10 μl Aliquot in ein leeres 1,8 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie sofort 0,390 ml Spermienaktivierungslösung tropfenweise über 10-20 s hinzu und mischen Sie das Sperma vorsichtig in die Lösung. Dies ergibt ein Verdünnungsverhältnis von 1:39 (Spermien: Lösung, v/v) (oder Verdünnungsfaktor von 40), was eine angemessene Konzentration für die CASA-Beurteilung (~50 × 106/ml) bietet, wenn die Rohspermienkonzentration ~2 × 109 Spermien/ml beträgt. Drehen Sie das Röhrchen 5 Mal um und schnippen Sie vor dem Öffnen mit dem Röhrchendeckel, um die Lösung am Boden des Röhrchens abzusetzen.HINWEIS: Die Spermienkonzentration für CASA sollte im Bereich von 8-50 × 106/ml liegen, um eine genaue Spermienverfolgung zu ermöglichen17. Dem Aliquot des Rohspermas kann bei Bedarf eine zusätzliche Spermienaktivierungslösung zugesetzt werden, um die Konzentration zu reduzieren. Berechnen Sie die Verdünnungsrate neu und geben Sie diesen Wert in die Tabelle ein. In Fällen, in denen viele Proben gleichzeitig verarbeitet werden müssen, können die 1,8-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,390 mL Spermienaktivierungslösung vorgeladen werden, wobei das 10-μl-Aliquot der Spermienprobe direkt hinzugefügt und dann gut gemischt wird, indem das Röhrchen 10× umgedreht und der Röhrchendeckel vor dem Öffnen geöffnet wird. Beurteilung der Spermienmotilität und -konzentration der aktivierten Probe mittels computergestützter Spermienanalyse (CASA), wie in Zuchowicz et al.17 beschrieben, durch Platzieren von 4 μl aktivierter Spermiensuspension auf einer Makler-Zählkammer20 oder durch visuelle Beurteilung und Hämozytometerzählung unter Phasenkontrastmikroskopie, wie in Hagedorn et al.4 beschrieben.HINWEIS: Die Makler-Kammer und das Deckglas müssen gut mit 70 % Ethanol gereinigt, dann mit destilliertem Wasser gereinigt und zwischen den Proben mit einem fusselfreien Taschentuch abgewischt werden. Geben Sie den für die CASA-Bewertung verwendeten Spermienverdünnungsfaktor ein und geben Sie die CASA-Ausgaben für die Spermienkonzentration (Millionen/ml), die Gesamtmotilität (%) und die progressive Motilität (%) in das Auto-Datenblatt ein.HINWEIS: Zusätzliche CASA-Metriken, einschließlich der durchschnittlichen Bahngeschwindigkeit (VAP), der geradlinigen Geschwindigkeit (VSL) und der krummlinigen Geschwindigkeit (VCL), können optional in das automatische Datenblatt aufgenommen oder später aus gespeicherten CASA-Dateien abgerufen werden. Schreiben Sie die Spermienkonzentration auf das gefilterte Samenprobenröhrchen und übertragen Sie die Probe in der gleichen Reihenfolge wie bei der Aufteilung und Verarbeitung des Bündels an den Kryokonservierungsarbeitsplatz. 3. Spermienverdünnung und Kryoprotektiva-Äquilibrierung Öffnen Sie an der Kryokonservierungs-Workstation dieselbe automatische Datenblatt-Datei für das Korallenbiobanking, die auch von der Workstation für die Spermienbewertung verwendet wird, und wählen Sie die Registerkarte Kryokonservierung . Überprüfen Sie das Etikett des Samenprobenahmeröhrchens und identifizieren Sie den entsprechenden Eintrag, indem Sie die Kolonie-ID (Spalte C) überprüfen. Wenn Sie nicht gleichzeitig zwischen Workstations auf dieselbe Auto-Datenblatt-Datei zugreifen, geben Sie die Daten manuell in die Kolonie-ID (Spalte C) und die Spermienkonzentration (Spalte F) in das Auto-Datenblatt ein. Messen Sie mit einer serologischen Pipette das Volumen der Spermienprobe, indem Sie die Probe in die Pipette ziehen und wieder in dasselbe Röhrchen ausstoßen. Geben Sie den Wert in Spalte E ein. Überprüfen Sie die automatisch berechnete Spalte I auf die erforderliche Kryoprotektivmittelkonzentration und Spalte H auf das Volumen des hinzuzufügenden Kryoverdünnungsmittels (Tabelle 1). Starten Sie einen Timer für 10 Minuten und beginnen Sie mit einer serologischen Pipette sofort mit der tropfenweisen Zugabe des Kryoverdünnungsmittels unter konstantem sanftem Mischen der Probe, wobei Sie sicherstellen, dass Einweghandschuhe für die Handhabung des DMSO getragen werden. Die Zugabezeit des Kryoverdünnungsmittels ist in Spalte P aufzuzeichnen. Konzentration der Spermien Kryoverdünnungsmittel Verdünnungsverhältnis (Spermien:Kryoverdünnungsmittel) Endgültige DMSO-Konzentration in der Spermienprobe (%) < 2 × 109/ml 30% DMSO in FSW 2:1 10% ≥ 2 × 109/ml 20% DMSO in FSW 1:1 10% Tabelle 1: Kryoverdünnungsmittelkonzentration und Verdünnungsverhältnisse für die Kryokonservierung von Korallenspermien, basierend auf der Bewertung der Gesamtspermienkonzentration in der zu kryokonservierenden Probe. 4. Kryokonservierung von Spermien Lesen Sie Spalte K , um zu bestimmen, wie viele Kryoröhrchen gefüllt werden müssen. Diese wird automatisch aus dem Gesamtvolumen der Spermien und dem gewünschten Volumen pro Fläschchen (in den meisten Fällen 1 ml) berechnet. Führen Sie während der 10-minütigen Inkubationszeit die Schritte 4.2 bis 4.6 aus. Entschließen Sie sterile Kryoröhrchen mit Barcode und setzen Sie die Verschlüsse auf eine saubere/sterile Oberfläche. Optional: Schreiben Sie den Lauf # mit einem Permanentmarker auf jedes Kryofläschchen; Dies kann bei der schnellen Identifizierung von Proben für die Aufnahme in die Biobank hilfreich sein. Mit einer serologischen Pipette und einer aliquotierenden Pipette, die auf das gewünschte Probenvolumen (1 ml) eingestellt ist, aliquotieren Sie die Proben in unverschlossene barcodierte Kryofläschchen und Recap-Fläschchen. Stellen Sie ein Thermoelement-Fläschchen und alle vollen Probenfläschchen bei Raumtemperatur auf ein leeres Kryo-Rack. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche mit Barcode auf allen Fläschchen nach außen zeigt. Platzieren Sie bei Bedarf zusätzliche Dummy-Kryoröhrchen mit 10 % DMSO in FSW in den leeren Räumen des Kryoracks, um sicherzustellen, dass alle Räume belegt sind. Geben Sie die Laufnummer in das Auto-Datenblatt (Spalte U) ein und scannen Sie die Seriennummer des Kryo-Racks (QR-Code) in Spalte V. Platzieren Sie den Cursor in der richtigen Zelle von Spalte Z und scannen Sie das Thermoelementfläschchen ein, gefolgt von allen Kryoröhrchen, die auf dem Gestell geladen sind (ab Spalte AA ). Vermeiden Sie es, das Gestell auf die Seite zu kippen, um sicherzustellen, dass die Probe nicht in das Gewinde des Fläschchens gelangt. Überprüfen Sie während des Scanvorgangs, ob die Daten in die richtige Zelle eingegeben wurden und ob alle Kryoröhrchen einmal gescannt wurden. Stellen Sie beladene und gescannte Gestelle für den Rest der Gleichgewichtsperiode des Kryoprotektivums beiseite und bereiten Sie das Kühlgefäß für die Kryokonservierung vor. Füllen Sie den Kühlbehälter des Kryo-Racks mit flüssigem Stickstoff bis zu dem für die Kühlung bei ca. -20 °C/min erforderlichen Niveau.HINWEIS: Stickstoff sollte nur in gut belüfteten Räumen verwendet werden, da Erstickungsgefahr besteht. Beim Umgang mit flüssigem Stickstoff müssen geschlossene Schuhe, Schutzbrillen/Gesichtsschutzschilde und Kryohandschuhe getragen werden. Spezifische Informationen über den Umgang und die Verwendung von flüssigem Stickstoff finden Sie in den institutionellen Leitlinien. Schließen Sie am Ende der 10-minütigen Kryoprotektivmittel-Äquilibrierungsperiode die Thermoelementsonde an den Datenlogger an und beginnen Sie mit der Aufzeichnung, setzen Sie dann das volle Kryo-Rack vorsichtig in das Kühlgefäß ein und setzen Sie den Deckel auf. Notieren Sie die Startzeit in Spalte Q. Sobald das Thermoelementfläschchen auf dem Datenlogger -80 °C oder darunter anzeigt, schrecken Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ab, indem Sie den Kryo-Rack-Einsatz in ein Flüssigstickstoffbad in einem separaten Gefäß, z. B. einer Styroporbox, überführen. Nehmen Sie die Kryofläschchen aus dem Gestell und übergeben Sie sie für den Transport zum Biorepository in einen Trockentransporter.

Representative Results

Die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte bauen auf den ursprünglichen Methoden zur Kryokonservierung von Korallenspermien auf, die von Hagedorn et al.4 beschrieben und von Zuchowicz et al.6 nachträglich verfeinert wurden, und bieten wichtige Verbesserungen zur Steigerung der Effizienz der Spermienverarbeitung für die Kryokonservierung und das Biobanking. Die Verwendung von Kryoröhrchen mit Barcode und einem aliquotierenden Autopipetteur vereinfacht das Verpackungsverfahren für Spermien, da Kryofläschchen nicht mehr bedruckt und von Hand etikettiert werden müssen, und die Belastung durch das manuelle Pipettieren großer Mengen von Proben reduziert wird. Wichtig ist, dass diese Verbesserungen auch die Zeit für die Probenvorbereitung für die Kryokonservierung von etwa 8-10 Minuten auf unter 5 Minuten reduzieren. Zusammen mit dem Einsatz von CASA reduzieren diese Verbesserungen die Anzahl der für ein effizientes Biobanking von Korallenspermien erforderlichen Personals von 4 auf 6 bei den ursprünglichen Methoden auf nur zwei Personen mit dem aktuellen Protokoll. Darüber hinaus bedeutet die Verwendung von Kryofläschchen mit Barcodes, dass jedes Röhrchen über eine eindeutige Kennung verfügt, so dass jedes Röhrchen innerhalb der Datenbank mit höherer Auflösung als bei der vorherigen Methode mit chargengedruckten Etiketten verfolgt werden kann. Feldtests des Protokolls bei zwei Laichereignissen während der Laichsaison 2022 am Great Barrier Reef in Australien führten zur Kryokonservierung und Biobank von 389 Proben aus 57 Kolonien von 5 Arten durch zwei Bediener (eine Person für CASA, eine Person für die Kryokonservierung), wobei eine weitere Person bei Bedarf beim Aufbrechen des Bündels und der Spermientrennung half. Während des Laichereignisses im November 2022 auf Konomie (North Keppel Island) in Queensland, Australien, wurden 150 Proben von 24 Kolonien von Acropora millepora von zwei Bedienern über einen Zeitraum von 2 Stunden kryokonserviert. Die effiziente Verarbeitung und Kryokonservierung dieses Probenvolumens aus einer so großen Anzahl von Korallenkolonien wurde vor allem durch die Effizienzsteigerungen bei der Probenvorbereitung und die vereinfachte Übertragung von Metadaten zwischen den Arbeitsplätzen ermöglicht. Weitere Tests des Arbeitsablaufs während des Laichens im Dezember 2023 ergaben, dass die Makler-Zählkammer für Korallenspermien genauere Motilitäts- und Konzentrationsdaten lieferte als kommerziell erhältliche Objektträger mit fester Deckglas-Einwegkammer, die üblicherweise bei CASA-Systemen verwendet werden. Die Makler-Zählkammer wurde für CASA validiert, wobei kommerziell erhältliche Latex-Mikrokügelchen in einer bekannten Konzentration mit einem Probenvolumen von 4 μl und den für Korallenspermien verwendeten Standard-CASA-Einstellungen17 verwendet wurden. Diese Analysen zeigten konsistente Zahlen mit geringer Variabilität (44,5 ± 0,7 Millionen/ml), die innerhalb des vom Hersteller angegebenen erwarteten Konzentrationsbereichs (46,0 ± 7,0 Millionen/ml) lagen (Abbildung 2). Ein Vergleich der CASA-Daten für Acropora millepora , die mit der Makler-Zählkammer und den Objektträgern mit fester Deckglaskammer gesammelt wurden, ergab einen signifikanten Unterschied in der Spermienkonzentration zwischen den beiden Kammertypen (P = 0,002; Abbildung 2), wobei die Objektträger mit festem Deckglas weniger als die Hälfte der mit der Makler-Zählkammer ermittelten Konzentration registrierten. Dieser Trend wurde auch in Spermaproben von zwei anderen Korallenarten beobachtet (Daten nicht gezeigt). Bei Tests im Dezember 2023 wurde auch kein signifikanter Unterschied in den Konzentrationen von gesamten, beweglichen oder progressiv beweglichen Spermien nach dem Auftauen in Proben festgestellt, die entweder mit einer 1:1-Verdünnung mit 20 % DMSO oder einer 1:2-Verdünnung (Spermien: Kryoverdünnungsmittel) mit 30 % DMSO kryokonserviert wurden (Abbildung 3). Abbildung 1: Der Arbeitsablauf für die halbautomatische Verarbeitung von Korallenspermien für die Kryokonservierung und Beispiele für mobile Geräte, die vor Ort eingesetzt werden. (A) Korallengametenbündel werden in einem Verhältnis von 5 ml-Bündeln über 5 ml FSW gesammelt und aufgebrochen, um Eier und Spermien zu trennen (i). Die Metadaten der Kolonie werden in das Autodatenblatt eingetragen (ii), und die isolierte Spermienprobe wird mit Hilfe der computergestützten Spermienanalyse (CASA) bewertet (iii). Parameter für die Spermienqualität werden dem Autodatenblatt hinzugefügt, um die Zugabe von 20 % oder 30 % DMSO in FSW (iv) zu berechnen, und die verdünnte Probe wird in barcodierte Kryoröhrchen aliquotiert (v). Die Kryofläschchen werden in das Kryo-Rack geladen und in das Auto-Datenblatt (vi) eingescannt und dann mit einer Geschwindigkeit von -20 °C/min auf -80 °C (vii) abgekühlt. Die Proben werden dann in flüssigem Stickstoff abgeschreckt und für den Transport zur Taronga CryoDiversity Bank (viii) auf Trockentransporter umgebracht. (B) Beispiel für die CASA- (links) und Kryokonservierungsstationen (rechts), die an einem abgelegenen Feldstandort im Klassenzimmer des Umweltbildungszentrums von Konomie eingerichtet wurden. (C) Beispiel für die laborbasierte Kryokonservierungsstation mit hoher Kapazität, die am National Sea Simulator des Australian Institute of Marine Science für den Betrieb mehrerer Kryo-Racks eingerichtet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Vergleich von zwei verschiedenen Kammerobjektträgern zur Messung der Korallenspermienkonzentration. (A) Vergleich der Messungen der Gesamtspermienkonzentration bei Acropora millepora (n = 3 Individuen) unter Verwendung der Makler-Zählkammer und handelsüblicher fester Deckglaskammer-Objektträger. Die Spalten zeigen den Mittelwert ± SEM.; Sternchen weisen auf einen signifikanten Unterschied hin (P = 0,002). (B) Validierung der Makler-Zählkammer unter Verwendung von handelsüblichen Latex-Mikrokügelchen in einer bekannten Konzentration und Standard-CASA-Einstellungen für Korallenspermien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Konzentrationen von gesamten, beweglichen oder progressiv beweglichen Spermien nach dem Auftauen in kryokonservierten Proben. Vergleiche der gesamten, beweglichen und progressiv beweglichen Spermienkonzentrationen nach dem Auftauen unter Verwendung von entweder 20 % oder 30 % DMSO in FSW, um die endgültige DMSO-Konzentration von 10 % für die Kryokonservierung zu erreichen. Proben von n = 3 Individuen wurden in jeweils 2 Aliquots aufgeteilt, wobei ein Aliquot mit einer 1:1-Zugabe von 20 % DMSO kryokonserviert wurde und das zweite Aliquot auf <2 × 109/ml verdünnt wurde, wobei FSW für die Kryokonservierung mit einer 1:2-Zugabe (Spermien: Kryoverdünnungsmittel) von 30 % DMSO verwendet wurde. Die Spalten zeigen die mittlere ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Datei 1: Automatisches Datenblatt für das Coral-Biobanking. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Der in diesem Protokoll beschriebene halbautomatische Verarbeitungsweg ermöglicht die effiziente Verarbeitung und Kryokonservierung von Korallenspermien, um die Genetik bedrohter Arten zu sichern und die Wiederherstellung und Anpassung an Riffe zu unterstützen. Die Motivation für die Entwicklung dieses Protokolls war der Mangel an bestehenden Systemen, die für die Durchsatzanforderungen der Kryokonservierung von Korallenspermien und die Verwendung von Kryoröhrchen geeignet sind, da Hochdurchsatz-Verarbeitungssysteme für die Kryokonservierung von Spermien in der Regel auf der Probenverpackung in 0,25 mL oder 0,5 mL französischen Strohhalmen basieren21,22. Im Vergleich dazu werden Kryofläschchen im Allgemeinen entweder in kleinem Maßstab für die Verarbeitung mit niedrigem Durchsatz (z. B. Kryokonservierung von Laborproben für die Forschung 23,24) oder in Hochdurchsatz-Verarbeitungssystemen für Massenproben mit teuren, nicht tragbaren Geräten (z. B. Zellkulturverarbeitung für die Industrie 18,25) verwendet ). Wir untersuchten auch das Potenzial für den Einsatz eines Auto-Decapping-Systems, um die Entnahme und den Austausch von Kryoröhrchenkappen zu rationalisieren, aber die Systeme waren nur für einzelne Kryoröhrchen oder für ganze Kryoröhrchengestelle verfügbar, so dass sie keine kostengünstige Lösung boten. Derzeit gibt es weltweit mehrere Gruppen, die das von Hagedorn et al.4 entwickelte Kryokonservierungsprotokoll verwenden, um die genetische Vielfalt von Korallen zu sichern, und es ist wichtig, dass diese Arbeit auf weitere Riffe auf der ganzen Welt ausgeweitet wird. Daher war eine wichtige Überlegung bei der Entwicklung des aktuellen Protokolls die Notwendigkeit, kostengünstige und zugängliche Technologien zu nutzen, die von diesen anderen Gruppen leicht implementiert werden können und die für neue Gruppen, die mit der Kryokonservierung von Korallenspermien beginnen möchten, nicht unerschwinglich sind.

Eine Schlüsselkomponente des beschriebenen Protokolls ist die verbesserte Handhabung von Beispiel-Metadaten über verknüpfte Tabellenkalkulationen in Microsoft Excel. Die Dateneingabe ist im Allgemeinen einfach, aber es muss beachtet werden, dass die Bearbeitung von Informationen in den automatischen Datenblättern nur durch Löschen und erneutes Eingeben von Informationen erfolgen sollte, da Schnellfunktionen (z. B. Strg + C, Strg + V) zum Bearbeiten von Daten möglicherweise gleichzeitige Eingaben durch andere Benutzer beeinträchtigen und Probleme bei der Datenverknüpfung zwischen Tabellenkalkulationen verursachen können. Eine wichtige Metadatenkomponente ist ein eindeutiger Identifikator (nämlich die Kolonie-ID), der mit der Donorkolonie verknüpft ist und in allen Phasen des Verarbeitungswegs an die Probe angehängt wird. Es ist wichtig, dass die Probenröhrchen zum Zeitpunkt der Bündelentnahme deutlich mit der Kolonie-ID gekennzeichnet sind und dass diese Informationen genau auf alle neuen Röhrchen übertragen werden, in die die Probe während der Vorbereitung (z. B. während der Filtration zur Trennung von Eizellen und Spermien oder für die Zugabe von Kryoverdünnungsmitteln) übertragen wird. Obwohl das Protokoll die automatische Übertragung von Informationen zur Probenqualität vom CASA-Bediener zur Kryokonservierungsworkstation ermöglicht, können Probleme auftreten, wenn die Internet- oder Wi-Fi-Abdeckung schlecht ist. Wenn Verzögerungen bei der Datenübertragung auftreten, wird empfohlen, dass die beiden Arbeitsstationen offline arbeiten und separate automatische Datenblätter führen, die anschließend abgeglichen werden können. Die wichtigsten Informationen, die der Bediener der Kryokonservierung benötigt, sind die Kolonie-ID und die Probenkonzentration, daher wird empfohlen, dass der CASA-Bediener die Probenkonzentration als Backup auf das Probenröhrchen schreibt, um sicherzustellen, dass diese Informationen für die Vorbereitung der Kryokonservierung zur Verfügung stehen, wenn es zu einer Verzögerung beim Hoch- oder Herunterladen von Metadaten zwischen Computern kommt.

Die Auswahl an Barcode-Scannern und barcodierten Kryofläschchen, die für dieses Protokoll verwendet werden, kann je nach Budget und Produktverfügbarkeit variiert werden. Es gibt jedoch einige Schlüsselelemente, die bei ihrer Auswahl berücksichtigt werden sollten. Der Barcode-Scanner sollte über die Fähigkeit verfügen, benutzerdefinierte Einstellungen vorzunehmen, insbesondere die Möglichkeit, die Dateneingabespezifikationen und die Richtung der Dateneingabe zu ändern. Die für dieses Protokoll verwendeten Auto-Datenblätter verwenden einen horizontalen Eintrag, aber in einigen Fällen (z. B. beim Beitritt in die Biobank oder für andere Laboranwendungen) kann ein vertikaler Eintrag erforderlich sein, daher ist es wichtig, dass diese Funktion anpassbar ist. Obwohl das Protokoll sowohl mit 1D- als auch mit 2D-Barcodes verwendet werden kann, wird empfohlen, dass die ausgewählten Kryoröhrchen eine für Menschen lesbare Komponente haben (z. B. enthalten 1D-Barcodes in der Regel eine eindeutige Nummer), um eine Gegenkontrolle des Probeneingangs während der Kryokonservierung zu ermöglichen. Zusätzlich zur Probeneingabe kann der Barcode-Scanner verwendet werden, um die Eingabe einiger Metadatenfelder zu automatisieren, indem QR-Codes für Informationen erstellt und ausgedruckt werden, die sich vor dem Laichen in den Proben wiederholen (z. B. Artennamen, Daten und Riffstandorte). Diese Informationen können dann schnell und einfach durch Scannen mit dem Barcode-Scanner in die Auto-Datenblätter eingetragen werden. Darüber hinaus ist es durch das Anbringen von Seriennummern-Barcodes an jedem Kryo-Rack und jeder Thermoelementsonde auch möglich, jeden Kryokonservierungslauf mit einem bestimmten Satz von Geräten innerhalb der Datenbank zu verknüpfen, was für die Qualitätskontrolle und zur Identifizierung von Komponenten, die repariert oder ausgetauscht werden müssen, nützlich ist.

Die limitierenden Faktoren bei der Verarbeitung sind oft die Zeit, die mit dem Warten auf das Aufbrechen der Bündel verbracht wird, und die Zeit, die benötigt wird, um die Spermien vor der CASA und der Kryokonservierung zu filtern und von den Eizellen zu trennen. Es wird empfohlen, die Proben nach Möglichkeit in der Reihenfolge zu behandeln, in der die Bündel aufbrechen. Weitere Effizienzgewinne können jedoch durch das strategische Management von Aufträgen für die Probenbearbeitung erzielt werden. Wenn es beispielsweise 5 oder weniger Kryoröhrchen pro Kolonie gibt, aufgrund eines geringen Probenvolumens (d. h. weniger als 3 ml Spermien pro Kolonie) oder einer niedrigen Spermienkonzentration, die eine 2:1-Verdünnung mit Kryoverdünnungsmittel erfordert (d. h. weniger als 2 × 109/ml), dann ist es besser, Kryoverdünnungsmittel zu zwei Kolonieproben gleichzeitig hinzuzufügen, damit sie zusammen auf demselben Kryogestell betrieben werden können (insgesamt # verfügbare Slots = 11). anstatt sie separat mit Dummys laufen zu lassen, die die leeren Räume füllen. Darüber hinaus ist es möglich, mehrere Kryo-Racks gleichzeitig zu betreiben (für Proben >6 mL Volumen), vorausgesetzt, es wird darauf geachtet, dass alle Prozesse innerhalb der 10-minütigen Kryoverdünnungs-Äquilibrierungszeit abgeschlossen werden können, was den Probendurchsatz weiter erhöhen kann. Wenn jedoch mehrere Kryo-Racks betrieben oder mehrere Kolonien auf einem einzigen Kryo-Rack kombiniert werden, muss darauf geachtet werden, dass die Kryokonservierungsmetadaten der richtigen Probe im Auto-Datenblatt zugeordnet werden, insbesondere wenn die Proben in einer anderen Reihenfolge als ihrer CASA-Bewertung kryokonserviert werden.

Neben der Entwicklung des halbautomatischen Arbeitsablaufs bietet die vorliegende Protokollbeschreibung auch zwei methodische Vergleiche in Bezug auf die Spermienkonzentration, die darauf abzielen, die Ergebnisse der Spermienanalyse und der Kryokonservierung zu verbessern. Im Allgemeinen führt die Entnahme von 5 ml Gametenbündeln über 5 ml Meerwasser (Gesamtvolumen 10 ml) zu einer Spermienkonzentration von 2 × 109 Zellen/ml, aber es gibt Fälle, in denen die Spermienkonzentration aufgrund von Speziesunterschieden oder Bündeln, die während der Entnahme auseinanderbrechen, niedriger sein kann. Die Verwendung eines DMSO-Kryoverdünnungsmittels mit höherer Konzentration (30 % v/v) reduziert die Menge, um die Spermien verdünnt werden, um die Schwankungen der Spermienkonzentration im Kryofläschchen von Charge zu Charge zu minimieren. Wichtig ist, dass die Verwendung von 30 % DMSO zur Erreichung der endgültigen DMSO-Konzentration keinen Einfluss auf die Konzentration nach dem Auftauen oder die Motilitätsparameter hat, wie die repräsentativen Daten in Abbildung 3 zeigen. Der zweite methodische Vergleich bietet eine Alternative zu den für CASA typischerweise verwendeten Einmal-Deckglas-Objektträgern. Die größte Herausforderung bei der Verwendung von kommerziell erhältlichen Objektträgern für die Analyse von Korallenspermien besteht darin, dass sie die Genauigkeit der Motilitätsbeurteilung beeinträchtigen können, da die Spermien an der Objektträgerbeschichtung haften bleiben. Die Verwendung der Aktivierungslösung überwindet dieses Problem bei vielen, aber nicht bei allen Proben, daher wird weiterhin empfohlen, eine separate CASA-Analyse der Motilität mit einem einfachen Objektträger durchzuführen, um Zuverlässigkeit und Konsistenz zu gewährleisten. Die Verwendung einer Makler-Zählkammer überwindet die Notwendigkeit, Konzentration und Motilität separat zu analysieren, und verbessert möglicherweise die Genauigkeit von Konzentrationsmessungen (Abbildung 2), daher wird sie für die Verwendung mit dem aktuellen Protokoll empfohlen. Angesichts dieser Diskrepanz bei den Konzentrationsmessungen, ein Befund, über den bereits berichtet wurde20, ist es wichtig, neben den Daten zur Spermienqualität immer die Objektträgerdetails in der Datenbank aufzuzeichnen und, wo immer möglich, bei der Art des verwendeten Objektträgers konsistent zu sein, um die Variation von Charge zu Charge zu minimieren und zuverlässige Berechnungen des Spermien-Ei-Verhältnisses für die Befruchtung zu gewährleisten.

Der hierin beschriebene halbautomatische Prozess bietet einen standardisierten und effizienten Weg für die Kryokonservierung und Biobank von Spermien bedrohter Korallenarten unter Beibehaltung der Biosicherheit und Qualität der Probe. Das beschriebene Protokoll ist leicht übertragbar und relativ kostengünstig in Programmen auf der ganzen Welt zu implementieren, die daran arbeiten, die vorhandene Korallenvielfalt durch Kryokonservierung zu sichern, was unerlässlich sein wird, um das Aussterben zu verhindern und die für die Wiederherstellung der Riffe verfügbaren Ressourcen jetzt und in Zukunft zu maximieren.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den traditionellen Eigentümern von Konomie, dem Volk der Woppaburra, für die Erlaubnis, das in diesem Artikel beschriebene System während des Laichens auf dem Land im November 2022 zu testen, und dem Umweltbildungszentrum von Konomie für die Nutzung ihrer Einrichtungen. Wir möchten uns auch bei den Mitarbeitern und Wissenschaftlern des Australian Institute of Marine Science bedanken, die das Sammeln und Laichen von Kolonien im Rahmen des National Sea Simulator ermöglicht haben. Diese Arbeit wurde im Rahmen des Unterprogramms Kryokonservierung (RRAP-CP-01) für das Reef Restoration and Adaptation Program durchgeführt, einer Partnerschaft zwischen dem Reef Trust der australischen Regierung und der Great Barrier Reef Foundation, mit zusätzlicher Unterstützung der Taronga Conservation Society Australia, der Taronga Conservation Science Initiative und anderer Philanthropen, die die Taronga Foundation unterstützen.

Materials

Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller – Aliquotting pipette Vistalab 2100-1005 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
5 mL serological pipettes (bulk) Thermo Scientific  Nunc 170355 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
10 mL serological pipettes (bulk) Thermo Scientific Nunc  170356 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
P2 0.2–2 µL pipettor Gilson F144054M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P10 1–10 µL pipettor Gilson F144055M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P20 2–20 µL pipettor Gilson  F144056M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P200 20–200 µL pipettor Gilson F144058M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P1000 100–1000 µL pipettor Gilson F144059M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
Vacuum pump Millipore WP6122050 Preparation of filtered sea water for solution preparation
Reusable bottle-top filtration system Thermo Scientific DS0320-5045 Preparation of filtered sea water for solution preparation
0.22-µm filter discs, mixed cellulose esters  Merck Millipore GSWP04700 Preparation of filtered sea water for solution preparation
Filtered sea water N/A – Base medium for sperm activation and cryoprotectant solutions
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 Cryoprotectant chemical used at a final concentration of 10% v/v in filtered seawater for sperm cryopreservation
Caffeine Sigma-Aldrich C0750 Used to activate sperm motility
BSA heat shock fraction Sigma-Aldrich A9647 Used to minimise sperm adherance to CASA well slides
15-mL tubes – racked Thermo Scientific 339651 Preparation of sperm activation solution
50-mL tubes racked Thermo Scientific 339653 For collection of gamete bundles and filtered sperm samples
Transfer pipettes Thermo Scientific Samco 202PK To aid collection of gamete bundles from the water surface
100-µm filter baskets Fisher Scientific 22363549 To exclude eggs during separation of the sperm sample
Eppendorf racks Interpath 511029 Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Eppendorf 1.5-mL tube Eppendorf 30120086 Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Glass coverslips 18×18 mm Brand 4700 45 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Plain glass slides, precleaned, 75×25 mm Corning 2947 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Haemocytometer Hausser Scientific 1492 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
CASA slides (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B) IMV Technologies 025107 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Makler sperm counting chamber (CASA) IVFStore SM-373 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
accu-bead® counting beads Hamilton-Thorne 710111 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
CASA system + laptop Hamilton Thorne Ceros II Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Safety Glasses Generic – Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Lab coat Long sleeve, full length – Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Cryogloves (pair) Tempshield Mid-Arm Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Medium forceps Generic – For removing cryopreserved samples from the cryo racks and manipulating samples in liquid nitrogen
Barcode scanner (2D compatible) Zebra DS2278 For reading 1D and 2D barcodes on cryovials for sample management
2.0-mL CryoStorage Vial, external thread, pre-capped, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), linear and human readable Eppendorf 30079434 Barcoded cryovials for cryopreservation of sperm samples
Cryovial rack Simport T315 Rack to hold cryovials, with locking base to allow for one hand de-capping and capping
Freezing racks Custom – Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing rack lid Custom – Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container Isosteel  VA-9683  Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Lab timers Generic – For timing of cryoprotectant equilibration prior to cryopreservation
Nitrogen bath 9L BelArt M16807-9104 For quenching samples during cryopreservaton and holding samples during sorting and handling
Thermocouple data logger- multichannel Omega HH520 Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Thermocouple probe – Type K Omega 5SC-TT-K-30-36 Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Cryo pens/coloured permanent pen Staedtler Lumocolor 318 Optional for marking cryovial lids to assist with sample management
Dry Shipper – charged Taylor Wharton CXR100, or CX500 For transfer of cryopreserved samples from field/collection sites to the biorepository for storage
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References

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Daly, J., Hobbs, R., Zuchowicz, N., Hagedorn, M., O’Brien, J. K. A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture. J. Vis. Exp. (208), e66233, doi:10.3791/66233 (2024).
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