バイオバンキングと水産養殖をサポートするためのサンゴ精子の凍結保存のための半自動ワークフロー

本明細書に記載の方法は、雌雄同体および雌雄同体のサンゴ種の両方からの精子を処理し、凍結保存するために用いることができる。サンゴの産卵と、両方の生殖モードの精子凍結保存のための配偶子コレクションに関する一般的な紹介と入門書は、スミソニアン国立動物園保全生物学研究所のサンゴ凍結保存トレーニングコース19で見つけることができます。記載されている方法は、主に、ウォッパブラシーカントリーのケッペル島グループとオーストラリアのグレートバリアリーフのビンダルシーカントリーのデイビスリーフから収集された アクロポラミレポラ コロニーからの配偶子を使用して開発されました。サンゴと配偶子のすべての収集と使用は、関連する海の国の伝統的な管理者の自由な事前のインフォームドコンセントに基づいて行われました。この研究に使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。 1. 産卵前 – 精子活性化液と凍結希釈液のシステムチェックと調製 バーコードスキャナーが充電され、アクティブで、スプレッドシートデータを水平セルエントリとして入力するように設定されていることを確認します。この設定をカスタマイズするには、バーコードリーダーのユーザーマニュアルを参照してください。 CASA用のサンゴ精子活性化濃縮ストック溶液を準備します。注:使い捨て手袋は、活性化溶液の調製のために化学物質を取り扱うときに着用する必要があります。37°Cに設定されたチューブウォーマーを使用して、1.5 gのBSAを4 mLの滅菌精製組織培養水に溶解することにより、30%ウシ血清アルブミン(BSA)ストック溶液(5 mL)を調製するか、チューブをカップ状の手で保持し、定期的に穏やかに渦巻かせます(バイアルを振らないでください)。 溶液中に入れたら、組織培養水を使用して最終容量(5 mL)まで調製し、チューブに日付をラベル付けし、「30% BSA in H2O」とマークします。 冷蔵庫(4°C)で最大2週間保管してください。 0.2913 gのカフェインを24 mLのろ過海水(FSW)に溶解して、60 mMのカフェインストック溶液(25 mL)を調製します。 溶液中に入れたら、FSWを使用して最終容量(25 mL)まで調製し、チューブに日付をラベル付けして「FSW中の60 mMカフェイン」とマークします。 冷蔵庫で最大1か月間保管してください。注:FSW中のカフェインの最大溶解度は約71 mMです。 精子サンプル用の精子活性化ワーキング溶液を ~109 sperm/mL (FSW で 0.9% BSA + 12 mM カフェイン) で調製します。10 mLのワーキング溶液には、2.0 mLの60 mMカフェインストック溶液 + 0.3 mLの30% BSAストック溶液 + 7.7 mLのFSWを組み合わせます。 チューブに日付と「精子活性化作業溶液 – 0.9% BSA + 12 mM カフェイン」のラベルを付けます。 使用日ごとに調製し、室温(19〜30°C)で保存し、未使用の溶液は一日の終わりに廃棄してください。 凍結保護液(クライオ希釈剤)を調製します。凍結保護剤DMSOを取り扱うときは、使い捨て手袋を着用してください。注:FSWは、サンプル内の初期精子濃度と凍結保存されたアリコートの所望の最終精子濃度に応じて、さまざまな凍結保護剤濃度で調製されます。クライオ希釈液を調製する際は、DMSOを添加する前にFSWが50 mLチューブに分注されていることを確認してください。産卵前にサンゴが保持されているタンクシステムから原水を収集します(~35 pptの塩分濃度)。 0.2μmの非発熱性メンブレンフィルターを取り付けた真空ポンプに取り付けられたボトルトップろ過システムを使用して原水をろ過します。 精子濃度≥2×109 精子/mLの場合、50mLチューブに10mLのDMSO+40mLのFSWを組み合わせて、FSW中に20%DMSOを調製します。 精子濃度<2×109 精子/mLの場合、50mLチューブに15mLのDMSO+35mLのFSWを組み合わせて、FSW中に30%DMSOを調製します。 チューブに日付とDMSO濃度(30%DMSOまたは20%DMSO)をラベル付けします。 使用日ごとに調製し、室温(19〜30°C)で保存し、未使用の溶液は毎日の終わりに廃棄してください。注:DMSOとFSWを混合すると発熱反応が生じるため、クライオ希釈剤は使用前に十分に調製して室温まで冷却する必要があります。FSWは、この発熱を相殺するためのクライオ希釈剤の調製のために4°Cで保存できます。 熱電対データロガーを準備します。各凍結保存ランのおおよその冷却速度を測定するには、FSWに10% DMSOを含むクライオバイアルを置き、熱電対プローブを蓋を通して挿入し、精子サンプルと並んで凍結保存ラックのサンプルスロットに入れます。 熱電対バイアルを作成するには、バーコード付きのクライオバイアルのキャップに小さな穴を開けるか溶かし、その開口部からK型またはT型の熱電対を挿入します。熱電対プローブの先端を、バイアルが充填されたときにサンプルの中央に収まるレベルまで押し下げ、プローブの先端をバイアルの中央に保ち、バイアルの内側の壁との接触を防ぎます。キャップを密封し、熱電対プローブをホットグルーで所定の位置に保持します。 使い捨て手袋を着用して、バーコード付きのクライオバイアルに、凍結保存する精子サンプルの量に等しいFSW中の10%DMSOの量を満たします。 FSWで新鮮な10%DMSOを調製し、熱電対バイアルを毎日補充します。 2. 精子の準備と評価 雌雄同体種(例: .、アクロポラ 種)の場合、3 mLのトランスファーピペットを使用して水面から配偶子束を採取し、5 mLの海水(総容量10 mL)に対して5 mLの配偶子束の比率で標識された50 mLチューブに入れます。 淋病種の場合は、3 mLのトランスファーピペットを使用してポリープの口の近くから精子を採取し、サンプルを標識された50 mLチューブに入れてから、ステップ2.8に直接進みます。注:使い捨て手袋は、配偶子サンプルの収集と取り扱いには必要ありませんが、必要に応じて着用できます。手は真水でよく洗うか、交差汚染を避けるために各配偶子サンプル間で手袋を交換する必要があります。 雌雄同体種の場合は、束がバラバラになるまでサンプルを手で優しく渦巻かせて、精子-卵子束を攪拌します。注: 一部のモンティポラ 種は卵に毒素が含まれているため、精子の損傷を避けるために、最小限の攪拌でゆっくりとバラバラにする必要があります。 サンプルをチューブラックに2分間置いて、卵子が表面に浮かび、精子が沈殿するのを待ちます(卵子は表面にピンク/茶色の層を形成し、個々の卵子が見えます; 図1iを参照)。 精子を分離し、汚染された卵子を除去するには、清潔な3mLトランスファーピペットを使用してチューブの底から精子を穏やかに吸引します。 精子サンプルを、新しい滅菌済み50 mL遠心分離チューブの上に座っている100 μmセルストレーナーに移します。サンプルはフィルター内を簡単に流れる必要があります。フィルターを軽くたたいてサンプルの流れを促進し、必要に応じて、きれいなトランスファーピペットを使用してフィルターの下側から残留サンプルを収集できます。フィルターを取り外してから、チューブを緩くキャップして空気交換を可能にします。 ろ過された精子サンプルにコロニーIDをラベル付けし、サンプルを精子評価ワークステーションに移動します。 coral biobanking auto-datasheetファイル(補足ファイル1)を開きます。[精子評価] タブで、サンゴのコロニーのメタデータ (列 A から H) を入力します。 CASA評価のために精子を準備します。精子サンプルをよく混合し、10 μLのアリコートを空の1.8 mLマイクロ遠心チューブに移します。 すぐに0.390 mLの精子活性化作業溶液を10〜20秒かけて滴下し、精子を溶液に穏やかに混合します。これにより、希釈比は 1:39 (精子: 溶液, v/v) (または希釈係数 40) となり、生精子の濃度が ~2 ×× 109 sperm/mL の場合、CASA 評価に適した濃度 (~50 106/mL) が得られます。チューブを5回反転させ、開く前にチューブの蓋をはじいて、溶液をチューブの底に沈めます。注:CASAの精子濃度は、正確な精子追跡を可能にするために、8〜50×106 / mLの範囲にある必要があります17。必要に応じて、生精子アリコートに追加の精子活性化作業溶液を追加して、濃度を下げることができます。希釈率を再計算し、この値をスプレッドシートに入力します。多くのサンプルを同時に処理しなければならない場合は、1.8 mLの微量遠心チューブに0.390 mLの精子活性化ワーキング溶液をあらかじめロードし、10 μLの精子サンプルを直接加えた後、チューブを10×反転させ、チューブの蓋をはじいてから開封してよく混合することができます。 Zuchowicz et al.17に記載されているように、コンピューター支援精子分析(CASA)を使用して、4 μLの活性化精子懸濁液をMakler計数チャンバー20に置くか、Hagedorn et al.4に記載されているように、位相差顕微鏡下での視覚的評価と血球計算盤の計数により、精子の運動性と活性化サンプルの濃度を評価します。注:Maklerチャンバーとカバースリップは、70%エタノールでよく洗浄し、次に蒸留水で洗浄し、サンプル間で糸くずの出ないティッシュワイプで拭く必要があります。 CASA評価に用いた精子希釈係数を入力し、精子濃度(百万/mL)、総運動性(%)、進行性運動性(%)のCASA出力をオートデータシートに入力してください。注:平均経路速度(VAP)、直線速度(VSL)、曲線速度(VCL)などの追加のCASAメトリックは、オプションで自動データシートに含めることも、保存したCASAファイルから後で取得することもできます。 ろ過した精子サンプルチューブに精子濃度を書き込み、バンドルの分割と処理と同じ順序でサンプルを凍結保存ワークステーションに移します。 3. 精子の希釈と凍結保護剤の平衡化 凍結保存ワークステーションで、精子評価ワークステーションが使用しているのと同じサンゴバイオバンキング自動データシートファイルを開き、[ 凍結保存 ]タブを選択します。精子サンプルチューブのラベルを確認し、 コロニーID(列C)を確認して対応するエントリを特定します。ワークステーション間で同じ自動データシートファイルに同時にアクセスできない場合は、自動データシートの コロニーID(C列) と 精子濃度(F列) に手動でデータを入力します。 血清ピペットを使用して、サンプルをピペットに引き込み、同じチューブに排出することにより、精子サンプルの量を測定します。 列 E に値を入力します。 必要な凍結保護剤の濃度については自動計算された カラムI を、添加する凍結希釈剤の量については カラムH を確認してください(表1)。 タイマーを10分間開始し、血清ピペットを使用して、すぐにクライオ希釈剤の添加を開始し、サンプルを常に穏やかに混合しながら、DMSOの取り扱いに使い捨て手袋を着用します。 クライオ希釈液の添加時間を カラムPに記録します。 精子濃度 凍結希釈剤 希釈倍率(精子:凍結希釈液) 精子サンプル中の最終DMSO濃度(%) < 2 × 109 / mL FSWで30%DMSO 2:1 10% ≥ 2 × 109/mL FSWで20%DMSO 1:1 10% 表1:凍結保存するサンプル中の総精子濃度の評価に基づく、サンゴの精子の凍結保存のための凍結希釈剤の濃度と希釈比。 4. 精子の凍結保存 カラム K を読み取り、充填するクライオバイアルの数を決定します。これは、精子の総量とバイアルあたりの所望の量(ほとんどの場合1mL)から自動計算されます。10分間のインキュベーション期間中に、ステップ4.2から4.6に進みます。 滅菌バーコード付きクライオバイアルのキャップを外し、清潔で滅菌済みの表面にキャップをセットします。 オプション:油性マーカーを使用して、各クライオバイアルにrun#を書き込みます。これにより、バイオバンクへの登録のための迅速なサンプル同定が可能になります。 血清学的ピペットと分注ピペットを希望のサンプル量(1 mL)にセットして、キャップなしのバーコード付きクライオバイアルとリキャップバイアルにサンプルを分注します。 1つの熱電対バイアルとすべてのフルサンプルバイアルを空のクライオラックに室温で置きます。バーコード付きの表面がすべてのバイアルで外側を向いていることを確認してください。 必要に応じて、FSWに10% DMSOを含むダミーのクライオバイアルを追加でクライオラックの空きスペースに配置し、すべてのスペースが占有されるようにします。 自動データシート(列U)に実行番号を入力し、クライオラックのシリアル番号(QRコード)を列Vにスキャンします。 カーソルをカラムZの正しいセルに置き、熱電バイアルをスキャンし、続いてラックにロードされているすべてのクライオバイアルチューブ(カラムAA以降)をスキャンします。サンプルがバイアルの糸に入らないように、ラックを横に傾けないでください。 スキャン中に、データが正しいセルに入力されていること、およびすべてのクライオバイアルが一度スキャンされていることをクロスチェックします。 凍結保護剤の平衡化期間の残りの間、ロードしてスキャンしたラックを脇に置き、冷却容器を凍結保存のために準備します。 クライオラック冷却容器を、約-20°C/minでの冷却に必要な適切な所定のレベルまで液体窒素で満たします。注:窒素は窒息の危険性があるため、換気の良い場所でのみ使用してください。液体窒素を取り扱うときは、つま先が閉じた靴、安全眼鏡/フェイスシールド、およびクライオ手袋を着用する必要があります。液体窒素の取り扱いと使用に関する具体的な情報については、機関のガイドラインを参照してください。 10分間の凍結保護剤平衡化期間の終了時に、熱電対プローブをデータロガーに接続して記録を開始し、フルクライオラックを冷却容器にそっと置き、蓋をします。 Q列に開始時刻を記録します。 熱電対バイアルがデータロガーで-80°C以下を示したら、クライオラックインサートをポリスチレンボックスなどの別の容器内の液体窒素浴に移して、サンプルを液体窒素で急冷します。 クライオバイアルをラックから取り出し、ドライシッパーに移してバイオレポジトリに輸送します。