JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

זרימת עבודה חצי-אוטומטית לשימור בהקפאה של זרע אלמוגים לתמיכה בביו-בנקאות ובחקלאות ימית

Published: June 07, 2024
doi:
10.3791/66233
, , , ,
1Taronga Institute of Science and Learning,Taronga Conservation Society Australia, 2School of Biological, Earth and Environmental Sciences,University of New South Wales, 3Department of Mechanical Engineering,University of Minnesota, 4Hawaii Institute of Marine Biology,University of Hawaii, 5Smithsonian National Zoo and Conservation Biology Institute

Summary

פרוטוקול זה מתאר מסלול אוטומטי למחצה לשיפור היעילות והיכולת של עיבוד ושימור בהקפאה של זרע ממיני אלמוגים מאוימים, במטרה להבטיח מגוון גנטי ולתמוך במאמצי שיקום שוניות.

Abstract

שוניות האלמוגים עומדות בפני משבר כאשר תדירות אירועי ההלבנה הנגרמים על ידי התחממות האוקיינוס עולה, וכתוצאה מכך מתים אלמוגים בשוניות ברחבי העולם. אובדן המגוון הגנטי והמגוון הביולוגי עלול לפגוע ביכולתם של האלמוגים להסתגל לאקלים המשתנה, ולכן המאמצים לשמר את המגוון הקיים חיוניים כדי למקסם את המשאבים הזמינים לשיקום שוניות בהווה ובעתיד. הגישה היעילה ביותר להבטחת גנטיקה לטווח ארוך היא שימור בהקפאה וביו-בנקאות, המאפשרת אחסון קפוא של דגימות חיות בטמפרטורות קריוגניות בחנקן נוזלי ללא הגבלת זמן. שימור בהקפאה של זרע אלמוגים אפשרי מאז 2012, אך האופי העונתי של רבייה של אלמוגים פירושו שפעילויות ביו-בנקאיות מוגבלות למספר לילות בשנה בלבד כאשר מתרחשת השרצה מוקדמת. לכן, שיפור היעילות של עיבוד זרע אלמוגים ותהליכי עבודה של שימור בהקפאה חיוני למקסום הזדמנויות ביו-בנקאיות מוגבלות אלה. לשם כך, שמנו לנו למטרה לייעל את מסלולי עיבוד השימור בהקפאה עבור זרע אלמוגים על ידי התבססות על טכנולוגיות קיימות ויצירת גישה חצי-אוטומטית לייעול ההערכה, הטיפול והשימור בהקפאה של זרע אלמוגים. התהליך, המשלב ניתוח זרע בעזרת מחשב, קריובלים מקודדים וסדרה של גיליונות נתונים אוטומטיים מקושרים לעריכה סימולטנית על ידי משתמשים מרובים, משפר את היעילות הן של עיבוד הדגימות והן של ניהול המטא נתונים בשטח. באמצעות שילוב עם תוכניות מחקר רוחביות כגון תוכנית שיקום והתאמה של שוניות באוסטרליה, שימור בהקפאה יכול למלא תפקיד מכריע בתוכניות שיקום שוניות בקנה מידה גדול על ידי הקלה על הניהול הגנטי של אוכלוסיות חקלאות ימית, תמיכה במחקר לשיפור סובלנות תרמית, ומניעת הכחדה של מיני אלמוגים. ההליכים המתוארים ישמשו עבור מומחי שימור אלמוגים וביו-בנקאות בשוניות ברחבי העולם ויספקו מודל למעבר של טכנולוגיות שימור בהקפאה ממעבדות מחקר ליישומים בקנה מידה גדול.

Introduction

שוניות אלמוגים ברחבי העולם חוות אובדן של מיני אלמוגים, אוכלוסיות ומגוון גנטי עקב התחממות האוקיינוס והחמצה הנגרמת על ידי שינויי אקלים, מה שמקטין את יכולת הקיום של בתי גידול קריטיים אלה ומשפיע על המינים שהם תומכים בהם 1,2. הגישה היעילה ביותר להבטחת גנטיקה לטווח ארוך היא שימור בהקפאה וביו-בנקאות, המאפשרת אחסון קפוא של דגימות חיות בטמפרטורות קריוגניות בחנקן נוזלי ללא הגבלת זמן3. הפיתוח בשנת 2012 של שיטות לשימור בהקפאה של זרע אלמוגים4 איפשר לראשונה ביו-בנקאות של גנטיקה ממינים אלה והוביל לפיתוח המאגר הביולוגי הראשון לגנטיקה של אלמוגים בשנת 20125. מאז, פרוטוקול שימור הקפאה זה שוכלל עודיותר 6 ושימש להבטחת הגנטיקה של יותר מ-50 מינים של אלמוגים ברחבי העולם, כאשר 30 מינים מהם מגיעים משונית המחסום הגדולה באוסטרליה7. זרע אלמוגים בהקפאה יכול ליצור אלמוגים בריאים המתפתחים באופן נורמלי ושימשו כדי להקל על ניסויי זרימת גנים באוסטרליה8 ובקריביים9. בעוד שטכנולוגיות נמצאות כיום בפיתוח כדי לאפשר שימור בהקפאה של סוגי רקמות מורכבות כגון זחלים10 ורקמות אלמוגים בוגרים11,12, שימור בהקפאה של זרע אלמוגים הוא כיום הכלי המבוסס ביותר הזמין לביו-בנקאות שגרתית של גנטיקה של אלמוגים.

ככל שההשפעות על אוכלוסיות האלמוגים גדלו, מספר מדינות יזמו תוכניות בקנה מידה גדול לתמיכה בשיקום שוניות והסתגלות (למשל, תוכנית שיקום והסתגלות השונית [RRAP] באוסטרליה13) או כדי להבטיח אוכלוסיות אלמוגים שנותרו בסכנה (למשל, Florida Coral Rescue בארה”ב14). בהקשר של תוכניות אלה, שימור בהקפאה יכול להיחשב כטכנולוגיה מאפשרת, התומכת במחקר ובייצור אלמוגים בקנה מידה גדול בנוסף להבטחת המגוון הגנטי הקיים ומניעת הכחדה. שימור זרע בהקפאה יכול לאפשר שליטה רבה יותר על רבייה בין אוכלוסיות המופרדות פיזית או זמנית ויכול לאפשר ניהול גנטי של broodstock כדי לבחור תכונות רצויות כגון סובלנות תרמית או עמידות למחלות8. עד כה, ביו-בנקאות של זרע אלמוגים בוצעה בקנה מידה קטן יחסית לתמיכה בניהול המגוון הביולוגי7, כך שתידרש רמה מסוימת של שדרוג אם ביו-בנקאות כזו תעמוד בפוטנציאל שלה במסגרת תוכניות שיקום שוניות גדולות אלה. כמו בכל מאמצי שיקום שוניות המבוססים על רבייה של אלמוגים, המכשול העיקרי להגברת מאמצי הביו-בנק הוא התקופה המוגבלת שבה גמטות האלמוגים זמינות, מאחר שההשרצה ברוב מיני בוני השוניות חופפת לירח המלא בסוף האביב ותחילת הקיץ15, כלומר הגמטות זמינות רק להקפאה ולביו-בנקאות בכמה לילות בכל שנה. יתר על כן, באזורים שבהם מתרחשת השרצה המונית, למשל שונית המחסום הגדולה, ישנם בדרך כלל מינים רבים המשריצים בו זמנית או בהפרש של כמה שעות זה מזה באותו לילה15. לפיכך, נדרשים שיפורים במסלול שימור הזרע בהקפאה כדי להגדיל את קנה המידה והיעילות של העיבוד כדי למקסם את יכולת הביו-בנקאות במהלך חלונות ההשרצה השנתיים הקצרים הללו תוך הבטחת שלמות הדגימות והמטא-נתונים הקשורים.

שימור בהקפאה וביו-בנק של זרע אלמוגים כוללים כמה שלבים מרכזיים, החל מאיסוף הגמטות במהלך ההשרצה ועד להצטרפות דגימות למאגר הביולוגי ולמסד הנתונים (איור 1). התהליך מתחיל בהפרדת זרע מביציות (במינים הרמפרודיטים) או איסוף זרע מעמודת המים (במינים גונוכוריים), ולאחר מכן הערכת תנועתיות וריכוז הזרע. לאחר מכן משלבים זרע עם הגנה קריופרוטקטורית (ריכוז סופי של 10% v/v, דימתיל סולפוקסיד, DMSO) במי ים מסוננים (FSW) ומקוררים בטמפרטורה של -20°C/min במכשיר קירור מותאם אישית4. איטרציות מוקדמות של תהליך זה הסתמכו על הערכה חזותית של תנועתיות וריכוז הזרע באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה וספירות המוציטומטר, הדפסה ותיוג של צינורות כאשר הדגימות עובדו לשימור בהקפאה, צנרת ידנית של דגימות זרע להקפאה וקירור על מדף צף16 שתוכנן במיוחד. היישום של ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA)17 ופיתוח התקן קירור מודפס בתלת-ממד6 שיפרו את היעילות והאמינות של שימור זרע אלמוגים בהקפאה, אך מסלול עיבוד דגימות הזרע נותר במידה רבה זהה מאז הקמתו. בעוד שגישה זו מתאימה לעיבוד דגימות ממספר מתון של מושבות ומינים בליל השרצה, עבור כמויות גדולות ומספר מושבות (למשל, דגימות בודדות מ->10 מושבות בכל פעם), ישנם צווארי בקבוק במסלול השימור הקריוגני המעכבים את עיבוד הדגימות בזמן (כלומר, תוך שעתיים משחרור הזרע) מבלי לפגוע בפוטנציאל פוריות הדגימה. למרות שקיימות מערכות לטיפול בנוזלים בקנה מידה גדול עבור קריוביאלים (למשל, Thomas et al.18), הן מתוכננות בדרך כלל לעיבוד אצווה גדולה (כלומר, מתלים מרובים של קריובים) ואינן מתאימות להובלה ולשימוש בשטח, ולכן הן אינן חסכוניות עבור יישום זה. לכן, המחקר הנוכחי נועד לשפר את היעילות של שימור זרע אלמוגים בהקפאה על ידי הצגת ציוד אוטומציה נייד וזול ושיטות בשלבי מפתח במסלול העיבוד כדי למקסם את מספר הדגימות שניתן לשמר ביעילות בהקפאה בליל השרצה.

Protocol

ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי לעבד ולשמר בהקפאה זרע הן ממיני אלמוגים הרמפרודיטיים והן ממיני אלמוגים גונוכוריים. מבוא כללי ופריימר על השרצה של אלמוגים ואיסוף גמטה לשימור זרע בהקפאה עבור שני מצבי הרבייה ניתן למצוא בקורס הכשרה19 של גן החיות הלאומי של סמית’סוניאן והמכון לביולוגיה של שימור. השיטות המתוארות פותחו בעיקר באמצעות גמטות ממושבות Acropora millepora שנאספו מקבוצת איי קפל במדינת הים וופבורה ומשונית דייוויס במדינת ים בינדל בשונית המחסום הגדולה באוסטרליה. כל האיסוף והשימוש באלמוגים ובגמטות נעשה בהסכמה חופשית מראש ומודעת של האפוטרופוסים המסורתיים של מדינות הים הרלוונטיות. הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים. 1. טרום השרצה – בדיקות מערכת והכנת תמיסת הפעלת זרע והקפאה ודא שסורק הברקוד טעון, פעיל ומוגדר להזין נתוני גיליון אלקטרוני כהזנת תא אופקית. עיין במדריך למשתמש של קורא הברקוד כדי להתאים אישית הגדרה זו. הכינו הפעלת זרע אלמוגים פתרונות מלאי מרוכזים עבור CASA.הערה: יש ללבוש כפפות חד פעמיות בעת טיפול בכימיקלים להכנת תמיסת ההפעלה.הכינו תמיסת אלבומין בסרום בקר 30% (BSA) (5 מ”ל) על ידי המסת 1.5 גרם BSA ב-4 מ”ל של מי תרבית רקמה סטריליים מטוהרים בעזרת מחמם צינור המכוון ל-37°C או על ידי החזקת הצינור בידיים חתוכות, עם ערבול עדין תקופתי (אין לנער בקבוקון). לאחר התמיסה יש להכין עד לנפח הסופי (5 מ”ל) באמצעות מי תרבית רקמות, לתייג את הצינור עם התאריך, ולסמן “30% BSA ב- H2O”. מאחסנים במקרר (4°C) עד שבועיים. הכינו 60 מ”מ תמיסת מלאי קפאין (25 מ”ל) על ידי המסת 0.2913 גרם קפאין ב-24 מ”ל מי ים מסוננים (FSW). לאחר תמיסה, לפצות עד נפח הסופי (25 מ”ל) באמצעות FSW, לתייג את הצינור עם התאריך ולסמן “60 mM קפאין ב FSW”. מאחסנים במקרר עד חודש.הערה: המסיסות המרבית של קפאין ב-FSW היא כ-71 מילימול. הכן פתרון עבודה להפעלת זרע עבור דגימות זרע ב~ 109 זרע / מ”ל (0.9% BSA + 12 מ”מ קפאין ב- FSW).לפתרון עבודה של 10 מ”ל, שלב 2.0 מ”ל של תמיסת מלאי קפאין של 60 מ”ל + 0.3 מ”ל של 30% תמיסת מלאי BSA + 7.7 מ”ל של FSW. תייג את הצינור עם תאריך ו “פתרון הפעלת זרע עובד – 0.9% BSA + 12 mM קפאין”. יש להכין בכל יום שימוש, לאחסן בטמפרטורת החדר (19-30 מעלות צלזיוס), ולהשליך את התמיסה שאינה בשימוש בסוף היום. הכן פתרונות cryoprotectant (cryodiluents). ודא כי כפפות חד פעמיות נלבשות בעת הטיפול DMSO cryoprotectant.הערה: FSW מוכן עם ריכוזים קריופרוטקטיביים משתנים בהתאם לריכוז הזרע הראשוני בתוך דגימה ולריכוז הזרע הסופי הרצוי של אליציטוטים בהקפאה. בעת הכנת cryodiluent, ודא כי FSW הוא aliquoted לתוך צינור 50 מ”ל לפני הוספת DMSO.אספו מי ים גולמיים ממערכת המכלים שבה מוחזקים אלמוגים לפני ההשרצה (~35 מליחות ppt). סנן מי ים גולמיים באמצעות מערכת סינון מבקבוקים המחוברת למשאבת ואקום עם מסנן ממברנה לא פירוגנית בגודל 0.2 מיקרומטר. עבור ריכוז זרע ≥2 × 109 זרע / מ”ל, להכין 20% DMSO ב FSW על ידי שילוב 10 מ”ל של DMSO + 40 מ”ל של FSW בצינור 50 מ”ל. לקבלת ריכוז זרע <2 × 109 זרע / מ”ל, להכין 30% DMSO ב FSW על ידי שילוב 15 מ”ל של DMSO + 35 מ”ל של FSW בצינור 50 מ”ל. תייג את הצינור עם תאריך וריכוז DMSO, כלומר, 30% DMSO או 20% DMSO. יש להכין בכל יום שימוש, לאחסן בטמפרטורת החדר (19-30 מעלות צלזיוס), ולהשליך את התמיסה שאינה בשימוש בסוף כל יום.הערה: ערבוב של DMSO ו-FSW יוצר תגובה אקסותרמית, ויש להמציא את הקריודילואנט זמן רב לפני השימוש כדי לאפשר קירור לטמפרטורת החדר. FSW ניתן לאחסן ב 4 °C להכנת cryodiluent כדי לאזן את הדור חום זה. הכן datalogger thermocouple.כדי למדוד את קצב הקירור המשוער של כל ריצת שימור קריוגני, מקם קריוביאל המכיל 10% DMSO ב- FSW עם בדיקה תרמית המוחדרת דרך המכסה בחריץ הדגימה של מדף ההקפאה לצד דגימות הזרע. כדי ליצור בקבוקון thermocouple, לדחוף או להמיס חור קטן במכסה של cryovial ברקודד ולהכניס זוג תרמי מסוג K או T דרך הפתח. דחפו את קצה הבדיקה התרמו-זוגית כלפי מטה לרמה כזו שהיא תשב במרכז הדגימה כאשר הבקבוקון מלא, תוך שמירה על קצה הבדיקה ממורכז בבקבוקון כדי למנוע מגע עם דופן הבקבוקון הפנימית. אטמו את הפקק והחזיקו את הגשושית התרמית במקומה עם דבק חם. לובש כפפות חד פעמיות, מלא את הקריוביאל הברקודי בנפח של 10% DMSO ב- FSW השווה לנפח דגימת הזרע שיש לשמר בהקפאה. הכינו 10% DMSO טרי ב-FSW ומלאו בקבוקונים תרמיים מדי יום. 2. הכנת זרע והערכה עבור מינים הרמפרודיטיים (למשל, מיני אקרופורה ), אספו צרורות גמטה מפני המים באמצעות פיפטת העברה של 3 מ”ל והניחו אותם בצינור מסומן של 50 מ”ל ביחס של 5 מ”ל צרורות גמטה מעל 5 מ”ל מי ים (נפח כולל של 10 מ”ל). עבור מינים גונוכוריים, אספו זרע קרוב לפה הפוליפ באמצעות פיפטת העברה של 3 מ”ל והכניסו את הדגימה לצינור מסומן של 50 מ”ל, ואז המשיכו ישירות לשלב 2.8.הערה: כפפות חד פעמיות אינן נחוצות לאיסוף וטיפול בדגימות גמטה, אך ניתן ללבוש אותן במידת הצורך. יש לשטוף את הידיים ביסודיות במים מתוקים, או להחליף כפפות בין כל דגימת גמטה כדי למנוע זיהום צולב. עבור מינים הרמפרודיטים, עוררו את צרורות הזרע-ביצים על ידי ערבול עדין של הדגימה ביד עד שהצרורות יתפרקו.הערה: לחלק ממיני המונטיפורה יש רעלן בביצים, ולכן יש לאפשר להן להתפרק לאט עם תסיסה מינימלית כדי למנוע פגיעה בזרע. הניחו לדגימה לשבת במשך 2 דקות במדף צינור כדי לאפשר לביציות לצוף אל פני השטח ולזרע לשקוע (ביצים ייצרו שכבה ורודה/חומה על פני השטח, וביציות בודדות יהיו גלויות; ראו איור 1i). כדי להפריד את הזרע ולהסיר ביציות מזהמות, שאפו בעדינות את הזרע מתחתית הצינור באמצעות פיפטת העברה נקייה של 3 מ”ל. העבירו את דגימת הזרע למסננת תאים בגודל 100 מיקרומטר היושבת על גבי צינור צנטריפוגה סטרילי חדש בנפח 50 מ”ל. הדגימה צריכה לזרום בקלות דרך המסנן. הקישו על המסנן כדי לעודד את זרימת הדגימה, ובמידת הצורך, ניתן להשתמש בפיפטת העברה נקייה כדי לאסוף כל דגימה שיורית מצדו התחתון של המסנן. הסר את המסנן ולאחר מכן סגור את הצינור באופן רופף כדי לאפשר חילופי אוויר. תייגו את דגימת הזרע המסוננת עם מזהה המושבה והעבירו את הדגימה לתחנת העבודה להערכת זרע. פתח את קובץ גליון הנתונים האוטומטי של ביו-בנקאות אלמוגים (קובץ משלים 1). בכרטיסייה הערכת זרע, הזן את המטא-נתונים של מושבת האלמוגים (עמודות A-H). הכינו זרע להערכת CASA.מערבבים היטב את דגימת הזרע ומסירים אליציטוט 10 μL לצינור מיקרוצנטריפוגה ריק של 1.8 מ”ל. הוסף מיד 0.390 מ”ל של תמיסת הפעלת זרע טיפתית מעל 10-20 שניות, ערבוב עדין של זרע לתמיסה. זה נותן יחס דילול של 1:39 (זרע: תמיסה, v/v) (או גורם דילול של 40), המספק ריכוז מתאים להערכת CASA (~ 50 × 106/mL) אם ריכוז הזרע הגולמי הוא ~ 2 × 109 זרע / מ”ל. הפוך את הצינור 5 פעמים והחלק את מכסה הצינור לפני הפתיחה כדי למקם את התמיסה בתחתית הצינור.הערה: ריכוז הזרע עבור CASA צריך להיות בטווח של 8-50 × 106/מ”ל כדי לאפשר מעקב זרע מדויק17. ניתן להוסיף פתרון עבודה נוסף להפעלת זרע גולמי כדי להפחית את הריכוז במידת הצורך. חשב מחדש את קצב הדילול והזן ערך זה בגיליון האלקטרוני. במקרים בהם יש לעבד דגימות רבות בו זמנית, ניתן לטעון מראש את צינורות המיקרוצנטריפוגות של 1.8 מ”ל בתמיסת עבודה של הפעלת זרע ב- 0.390 מ”ל עם אליציטוט של 10 מיקרוליטר של דגימת זרע שנוסף ישירות אליה, ואז לערבב היטב על ידי היפוך הצינור 10× והזזת מכסה הצינור לפני הפתיחה. להעריך את תנועתיות הזרע ואת ריכוז הדגימה הפעילה באמצעות ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA) כמתואר ב- Zuchowicz et al.17 על ידי הנחת 4 μL של תרחיף זרע פעיל על תא ספירת Makler20 או על ידי הערכה חזותית וספירת המוציטומטר תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כמתואר ב- Hagedorn et al.4.הערה: יש לנקות היטב את תא Makler ואת הכיסוי עם 70% אתנול, ולאחר מכן מים מזוקקים, ולנגב עם מגבון רקמות ללא סיבים בין הדגימות. הזן את גורם דילול הזרע המשמש להערכת CASA והזן פלטי CASA עבור ריכוז זרע (מיליון/מ”ל), תנועתיות כוללת (%) ותנועתיות פרוגרסיבית (%) לגיליון הנתונים האוטומטי.הערה: מדדי CASA נוספים, כולל מהירות נתיב ממוצעת (VAP), מהירות קו ישר (VSL) ומהירות עקלקלה (VCL) יכולים להיכלל בגליון הנתונים האוטומטי או לאחזר מקבצי CASA שנשמרו מאוחר יותר. כתוב את ריכוז הזרע על צינורית דגימת הזרע המסוננת והעבר את הדגימה לתחנת העבודה לשימור בהקפאה באותו סדר כמו פירוק ועיבוד החבילה. 3. דילול זרע ושיווי משקל קריופרוטקטיבי בתחנת העבודה לשימור קריוגני, פתח את אותו קובץ גליון נתונים אוטומטי של ביו-בנקאות אלמוגים שבו משתמשת תחנת העבודה להערכת זרע ובחר בכרטיסייה שימור בהקפאה . בדוק את תווית צינור דגימת הזרע וזהה את הערך המתאים על ידי בדיקת מזהה מושבה (עמודה C). אם אינך ניגש לאותו קובץ גליון נתונים אוטומטי בו-זמנית בין תחנות עבודה, הזן ידנית נתונים במזהה המושבה (עמודה C) ובריכוז הזרע (עמודה F) בגליון הנתונים האוטומטי. באמצעות פיפטה סרולוגית, למדוד את נפח דגימת הזרע על ידי משיכת הדגימה לתוך פיפטה והוצאתה בחזרה לתוך אותו צינור; הזן את הערך בעמודה E. בדוק את עמודה I המחושבת אוטומטית עבור ריכוז cryoprotectant הנדרש ואת עמודה H עבור נפח cryodiluent שיש להוסיף (טבלה 1). הפעל טיימר למשך 10 דקות, ובאמצעות פיפטה סרולוגית, התחל מיד להוסיף את הקריודילואנט, טיפתית, עם ערבוב עדין מתמיד של הדגימה, תוך הקפדה על לבישת כפפות חד פעמיות לטיפול ב- DMSO. הקלט זמן הוספה קריודילואינטי בעמודה P. ריכוז זרע קריודילואינט יחס דילול (זרע:cryodiluent) ריכוז DMSO סופי בדגימת זרע (%) < 2 × 109/מ”ל 30% DMSO ב- FSW 2:1 10% ≥ 2 × 109/מ”ל 20% DMSO ב- FSW 1:1 10% טבלה 1: יחסי ריכוז ודילול קריודילואנטיים לשימור קריוגני של זרע אלמוגים, בהתבסס על הערכת ריכוז הזרע הכולל בדגימה שיש לשמר בהקפאה. 4. שימור זרע בהקפאה קרא את עמודה K כדי לקבוע כמה קריובלים למלא. זה מחושב אוטומטית מנפח הזרע הכולל והנפח הרצוי לכל בקבוקון (1 מ”ל ברוב המקרים). במהלך תקופת הדגירה של 10 דקות, המשך בשלבים 4.2 עד 4.6. יש להסיר את המכסה של קריובלים ברקודים סטריליים ולהניח את הפקקים על משטח נקי/סטרילי. אופציונלי: כתוב את הריצה # על כל קריוביאל באמצעות סמן קבוע; זה יכול לסייע בזיהוי דגימה מהיר להצטרפות לביובנק. באמצעות פיפטה סרולוגית ופיפטור aliquoting המוגדר לנפח הדגימה הרצוי (1 מ”ל), דגימות aliquot לתוך cryovials ברקודים uncaped ובקבוקוני סיכום. הניחו בקבוקון תרמי אחד ואת כל בקבוקוני הדגימה המלאה על מדף קריו ריק בטמפרטורת החדר. ודא שהמשטח הברקודי פונה כלפי חוץ בכל הבקבוקונים. במידת הצורך, מקם קריובאלי דמה נוספים המכילים 10% DMSO ב- FSW בכל חלל ריק במדף ה- cryo כדי להבטיח שכל החללים תפוסים. הזן את מספר ההפעלה בגליון הנתונים האוטומטי (עמודה U) וסרוק את המספר הסידורי של ארון התקשורת של ההקפאה (קוד QR) לעמודה V. מקם את הסמן בתא הנכון של עמודה Z וסרוק בבקבוקון התרמוזוג, ואחריו את כל הצינורות הקריביאליים המועמסים על המדף (עמודה AA ואילך). הימנע מהטיה של המדף על צדו כדי להבטיח שהדגימה לא תיכנס לחוט הבקבוקון. בזמן הסריקה, הצליבו שהנתונים מוזנים לתא הנכון ושכל הקריובלים נסרקו פעם אחת. הניחו בצד מתלים טעונים וסרוקים למשך שארית תקופת שיווי המשקל של ההגנה הקפאית והכינו את כלי הקירור לשימור בהקפאה. מלא את כלי הקירור של מתלה ההקפאה בחנקן נוזלי לרמה המתאימה שנקבעה מראש הדרושה לקירור בסביבות -20°C לדקה.הערה: יש להשתמש בחנקן רק באזורים מאווררים היטב מכיוון שקיים סיכון לחנק. יש ללבוש נעליים סגורות, משקפי בטיחות/מגני פנים וכפפות קריו בעת הטיפול בחנקן נוזלי. עיין בהנחיות המוסדיות לקבלת מידע ספציפי על טיפול ושימוש בחנקן נוזלי. בתום תקופת שיווי המשקל של 10 דקות, חבר את הבדיקה התרמו-זוגית לאוגר הנתונים והתחל להקליט, ולאחר מכן הכנס בעדינות את מתלה ההקפאה המלא לכלי הקירור והחל את המכסה. רשום את שעת ההתחלה בעמודה Q. ברגע שהבקבוקון התרמו-זוגי קורא -80 מעלות צלזיוס או פחות על אוגר הנתונים, הרוו את הדגימות בחנקן נוזלי על ידי העברת מתלה ההקפאה לאמבט חנקן נוזלי בכלי נפרד כגון קופסת פוליסטירן. הסר את הקריובלים מהמדף והעבר אותם למשלוח יבש להובלה למאגר הביולוגי.

Representative Results

הצעדים המתוארים בפרוטוקול זה מתבססים על השיטות המקוריות לשימור זרע אלמוגים בהקפאה שתוארו על ידי Hagedorn et al.4 ועל חידוד לאחר מכן על ידי Zuchowicz et al.6, ומספקים שיפורים מרכזיים להגברת היעילות של עיבוד זרע לשימור בהקפאה וביו-בנקאות. השימוש בקריובלים ברקודים ופיפטור אוטומטי מפשט את הליך אריזת הזרע על ידי הסרת הצורך להדפיס ולתייג ידנית קריובלים, ומפחית את המתח של צפירת ידנית מספר רב של דגימות. חשוב לציין, שיפורים אלה גם מפחיתים את הזמן הדרוש להכנת הדגימה לשימור בהקפאה, מסביבות 8-10 דקות לפחות מ-5 דקות. יחד עם השימוש ב-CASA, שיפורים אלה מפחיתים את מספר כוח האדם הדרוש לביו-בנקאות יעילה של זרע אלמוגים, מ-4 ל-6 בשיטות המקוריות, עד לשני אנשים בלבד המשתמשים בפרוטוקול הנוכחי. בנוסף, השימוש בקריובלים מקודדים פירושו שלכל שפופרת יש מזהה ייחודי, כך שניתן לעקוב אחר כל אחת מהן בתוך מסד הנתונים ברזולוציה גדולה יותר מהשיטה הקודמת באמצעות תוויות מודפסות אצווה. בדיקות שדה של הפרוטוקול בשני אירועי השרצה במהלך עונת ההשרצה של שונית המחסום הגדולה 2022 באוסטרליה הביאו לשימור בהקפאה וביו-בנק של 389 דגימות מ-57 מושבות על פני 5 מינים על ידי שני מפעילים (אדם אחד ל-CASA, אדם אחד לשימור בהקפאה), כאשר אדם אחד נוסף מסייע בפירוק צרור והפרדת זרע לפי הצורך. במהלך אירוע ההשרצה בנובמבר 2022 בקונומי (האי צפון קפל) בקווינסלנד, אוסטרליה, 150 דגימות מ-24 מושבות של Acropora millepora נשמרו בהקפאה על ידי שני מפעילים במשך תקופה של שעתיים. העיבוד היעיל והשימור בהקפאה של כמות דגימות זו ממספר כה גדול של מושבות אלמוגים התאפשרו בעיקר הודות ליעילות שהושגה בזמן הכנת הדגימות וההעברה הפשוטה יותר של מטא-נתונים בין תחנות עבודה. בדיקה נוספת של זרימת העבודה במהלך ההשרצה בדצמבר 2023 קבעה כי עבור זרע אלמוגים, תא הספירה של מקלר סיפק נתוני תנועתיות וריכוז מדויקים יותר בהשוואה לשקופיות חד-פעמיות חד-פעמיות זמינות מסחרית עם כיסוי קבוע. תא הספירה של מקלר אומת עבור CASA באמצעות מיקרו-כדוריות לטקס זמינות מסחרית בריכוז ידוע עם נפח דגימה של 4 μL והגדרות CASAסטנדרטיות 17 המשמשות לזרע אלמוגים. ניתוחים אלה הראו ספירות עקביות עם שונות נמוכה (44.5 ± 0.7 מיליון/מ”ל) שנפלו בטווח הריכוז הצפוי (46.0 ± 7.0 מיליון/מ”ל) שסופק על-ידי היצרן (איור 2). השוואה של נתוני CASA עבור Acropora millepora שנאספו באמצעות תא ספירת Makler ושקופיות תא הכיסוי הקבוע מצאה הבדל משמעותי בספירת ריכוז הזרע בין שני סוגי התאים (P = 0.002; איור 2), כאשר שקופיות תא הכיסוי הקבוע רושמות פחות ממחצית הריכוז שנקבע באמצעות תא הספירה של מקלר. מגמה זו נצפתה גם בדגימות זרע משני מיני אלמוגים אחרים (הנתונים אינם מוצגים). בדיקות שנערכו במהלך דצמבר 2023 גם לא מצאו הבדל משמעותי בריכוזים שלאחר ההפשרה של זרע כולל, תנועתי או תנועתי בהדרגה בדגימות שנשמרו בהקפאה באמצעות דילול 1:1 עם 20% DMSO או דילול 1:2 (זרע: קריודילואנט) עם 30% DMSO (איור 3). איור 1: תהליך העבודה המשמש לעיבוד חצי-אוטומטי של זרע אלמוגים לצורך שימור בהקפאה, ודוגמאות לציוד נייד המשמש בשטח. (A) צרורות גמטה אלמוגים נאספים ביחס של 5 מ”ל צרורות מעל 5 מ”ל FSW ומפורקים להפרדת ביציות וזרע (i). מטא-נתונים של מושבה מוזנים לגיליון הנתונים האוטומטי (ii), ודגימת הזרע המבודדת מוערכת באמצעות ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA) (iii). פרמטרים של איכות זרע מתווספים לגיליון הנתונים האוטומטי כדי לחשב את התוספת של 20% או 30% DMSO ב- FSW (iv), והמדגם המדולל מדולל לקריובלים מקודדים (v). הקריובלים נטענים על מדף ההקפאה ונסרקים לגיליון הנתונים האוטומטי (vi), ולאחר מכן מקוררים בקצב של -20°C/min עד -80°C (vii). לאחר מכן הדגימות מרוות בחנקן נוזלי ומועברות לשולחים יבשים להובלה לבנק Taronga CryoDiversity Bank (viii). (B) דוגמה לתחנות CASA (משמאל) ושימור בהקפאה (מימין) שהוקמו באתר שדה מרוחק בכיתה במרכז לחינוך סביבתי קונומי. (C) דוגמה לתחנת הקפאה מבוססת מעבדה בעלת קיבולת גבוהה שהוקמה כדי להפעיל מתלי קריותרפיה מרובים בסימולטור הים הלאומי של המכון האוסטרלי למדעי הים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: השוואה בין שתי אפשרויות שונות של שקופית תא למדידת ריכוז זרע אלמוגים. (A) השוואה של מדידות ריכוז הזרע הכולל ב- Acropora millepora (n = 3 פרטים) באמצעות תא ספירת Makler ושקופיות תא כיסוי קבוע הזמינות מסחרית. עמודות מציגות ממוצע ± SEM.; כוכביות מציינות הבדל משמעותי (P = 0.002). (B) אימות תא הספירה של מקלר באמצעות מיקרו-כדוריות לטקס זמינות מסחרית בריכוז ידוע ובהגדרות CASA סטנדרטיות לזרע אלמוגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: ריכוזים לאחר הפשרה של זרע כולל, תנועתי או תנועתי בהדרגה בדגימות הקפאה. השוואות לאחר הפשרה של ריכוזי זרע כוללים, תנועתיים ותנועתיים בהדרגה באמצעות 20% או 30% DMSO ב- FSW כדי להשיג את ריכוז ה- DMSO הסופי של 10% לשימור בהקפאה. דגימות מ n = 3 אנשים חולקו ל 2 aliquots כל אחד, עם aliquot אחד cryopreserved עם תוספת 1: 1 של DMSO 20% ואת aliquot השני מדולל ל <2 × 109/mL באמצעות FSW עבור cryopreservation עם תוספת 1: 2 (זרע: cryodiluent) של 30% DMSO. עמודות מציגות ממוצע ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. קובץ משלים 1: קובץ גליון נתונים אוטומטי של קורל ביו-בנקאות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

מסלול העיבוד האוטומטי למחצה המתואר בפרוטוקול זה מאפשר עיבוד יעיל ושימור בהקפאה של זרע אלמוגים כדי להבטיח גנטיקה ממינים מאוימים ולתמוך במאמצי שיקום והתאמה של שוניות. המניע לפיתוח פרוטוקול זה היה היעדר מערכות קיימות המתאימות לדרישות התפוקה של שימור זרע אלמוגים ושימוש בקריוביאלים, שכן מערכות עיבוד בתפוקה גבוהה לשימור זרע בהקפאה מבוססות בדרך כלל על אריזות דגימה ב 0.25 מ”ל או 0.5 מ”ל קשיות צרפתיות21,22. לשם השוואה, קריובלים משמשים בדרך כלל בקנה מידה קטן לעיבוד בתפוקה נמוכה (למשל, שימור בהקפאה של דגימות מעבדה למחקר23,24), או במערכות עיבוד בעלות תפוקה גבוהה עבור דגימות בתפזורת באמצעות ציוד יקר ולא נייד (למשל, עיבוד תרביות תאים לתעשייה18,25). חקרנו גם את הפוטנציאל לשימוש במערכת פירוק אוטומטי כדי לייעל את ההסרה וההחלפה של מכסים קריוביאליים, אך מערכות היו זמינות רק עבור קריובים בודדים או עבור ארונות קריוביאליים שלמים, ולכן הן לא סיפקו פתרון חסכוני. נכון לעכשיו, ישנן מספר קבוצות ברחבי העולם המשתמשות בפרוטוקול שימור הקפאה שהומצא על ידי Hagedorn et al.4 כדי להבטיח את המגוון הגנטי של אלמוגים, וחשוב שעבודה זו תמשיך להתרחב לשוניות נוספות ברחבי העולם. לכן, שיקול מרכזי בפיתוח הפרוטוקול הנוכחי היה הצורך להשתמש בטכנולוגיות חסכוניות ונגישות שיכולות להיות מיושמות בקלות על ידי קבוצות אחרות אלה, ואשר לא יהיו חסכוניות עבור קבוצות חדשות המעוניינות להתחיל בשימור זרע אלמוגים בהקפאה.

מרכיב מרכזי של הפרוטוקול המתואר הוא הטיפול המשופר במטה-נתונים לדוגמה באמצעות גליונות אלקטרוניים מקושרים ב- Microsoft Excel. הזנת נתונים היא בדרך כלל פשוטה, אך יש לציין כי עריכת מידע בגיליונות הנתונים האוטומטיים צריכה להיעשות רק על ידי מחיקה והזנה מחדש של מידע, מכיוון שפונקציות מהירות (לדוגמה, Ctrl + C, Ctrl + V) לעריכת נתונים עלולות להשפיע על קלט בו-זמני של משתמשים אחרים ועלולות לגרום לבעיות בקישור נתונים בין גיליונות אלקטרוניים. רכיב מטא נתונים חשוב הוא מזהה ייחודי (כלומר, מזהה מושבה) המקושר למושבת התורמים ומצורף לדגימה בכל שלבי מסלול העיבוד. חיוני שצינוריות הדגימה יסומנו בבירור עם מזהה המושבה בזמן איסוף הצרורות, ושמידע זה יתומלל במדויק על כל צינור חדש שאליו הדגימה מועברת במהלך ההכנה (למשל, במהלך סינון להפרדת ביציות וזרע, או להוספה קריודילואטית). למרות שהפרוטוקול מאפשר העברה אוטומטית של מידע איכותי לדוגמה ממפעיל CASA לתחנת העבודה לשימור קריוגני, ניתן להיתקל בבעיות כאשר כיסוי האינטרנט או ה- Wi-Fi גרוע. אם נתקלים בעיכובים בהעברת נתונים, מומלץ ששתי תחנות העבודה יעבדו במצב לא מקוון וישמרו גליונות נתונים אוטומטיים נפרדים שניתן ליישב לאחר מכן. המידע העיקרי הנדרש על ידי מפעיל השימור הקריוגני הוא מזהה המושבה וריכוז הדגימה, ולכן מומלץ למפעיל CASA לכתוב את ריכוז הדגימה על צינור הדגימה כגיבוי כדי להבטיח שמידע זה נמצא בהישג יד להכנת הקפאה במקרה של עיכוב בהעלאה או הורדה של מטא נתונים בין מחשבים.

ניתן לשנות את הבחירה בסורק ברקוד ובקריובלים מקודדים המשמשים לפרוטוקול זה כך שיתאימו לתקציב ולזמינות המוצר; עם זאת, ישנם כמה אלמנטים מרכזיים שיש לקחת בחשבון בבחירתם. סורק הברקוד צריך להיות בעל יכולת להגדרות מותאמות אישית, במיוחד היכולת לשנות את מפרטי קלט הנתונים ואת כיוון הזנת הנתונים. גיליונות הנתונים האוטומטיים המשמשים לפרוטוקול זה משתמשים בהזנה אופקית, אך במקרים מסוימים (למשל, הצטרפות לביובנק או לשימושים אחרים במעבדה) ייתכן שתידרש הזנה אנכית, ולכן חשוב שתכונה זו תהיה ניתנת להתאמה אישית. בעוד שניתן להשתמש בפרוטוקול הן עם ברקודים 1D והן עם ברקודים דו-ממדיים, מומלץ שלקריובלים שנבחרו יהיה רכיב קריא לבני אדם (למשל, ברקודים 1D כוללים בדרך כלל מספר ייחודי) כדי לאפשר הצלבה של הזנת הדגימה במהלך שימור בהקפאה. בנוסף להזנת הדגימה, ניתן להשתמש בסורק הברקוד כדי להפוך את הקלט של שדות מטא נתונים מסוימים לאוטומטי על ידי יצירה והדפסה של קודי QR למידע שחוזר על עצמו על פני דגימות (למשל, שמות מינים, תאריכים ומיקומי שוניות) לפני ההשרצה. לאחר מכן ניתן להזין מידע זה במהירות ובקלות לגיליונות הנתונים האוטומטיים על ידי סריקה באמצעות סורק הברקוד. יתר על כן, על ידי הצמדת ברקודים של מספרים סידוריים לכל מתלה קריו ובדיקה תרמית, ניתן גם לקשר כל ריצת הקפאה עם קבוצה ספציפית של ציוד בתוך מסד הנתונים, אשר שימושי לבקרת איכות ולזיהוי רכיבים הדורשים תיקון או החלפה.

הגורמים המגבילים בעיבוד הם לעתים קרובות הזמן המושקע בהמתנה לפירוק צרורות והזמן הדרוש כדי לסנן ולהפריד את הזרע מהביציות לפני CASA ושימור בהקפאה. במידת האפשר, מומלץ לעבד דגימות לפי סדר פירוק הצרורות; עם זאת, רווחים נוספים ביעילות ניתן לבצע באמצעות ניהול אסטרטגי של הזמנות עיבוד דגימה. לדוגמה, אם יש 5 קריובלים או פחות לכל מושבה עקב נפחי דגימה נמוכים (כלומר, פחות מ -3 מ”ל זרע למושבה) או ריכוז זרע נמוך הדורש דילול 2: 1 עם cryodiluent (כלומר, פחות מ 2 × 109/מ”ל), אז עדיף להוסיף cryodiluent לשתי דגימות מושבה בו זמנית, כך שהם יכולים לרוץ יחד על אותו מתלה cryo (סה”כ # חריצים זמינים = 11), במקום להריץ אותם בנפרד עם בובות שממלאות את החללים הריקים. בנוסף, ניתן להפעיל מספר ארונות קריותרפיה בו זמנית (עבור דגימות >6 מ”ל נפח) בתנאי שננקטת זהירות כדי להבטיח שניתן יהיה להשלים את כל התהליכים בתוך זמן שיווי משקל קריודילואינטי של 10 דקות, מה שיכול להגדיל עוד יותר את תפוקת הדגימה. עם זאת, בעת הפעלת ארונות קריותרפיה מרובים או שילוב מושבות מרובות במדף קריו יחיד, יש להקפיד להבטיח שהמטא-נתונים של שימור הקפאה מוקצים לדגימה הנכונה בגיליון הנתונים האוטומטי, במיוחד אם הדגימות נשמרות בהקפאה בסדר שונה מהערכתן ב- CASA.

בנוסף לפיתוח זרימת העבודה החצי-אוטומטית, תיאור הפרוטוקול הנוכחי מספק גם שתי השוואות מתודולוגיות הקשורות לריכוז הזרע שמטרתן לשפר את ניתוח הזרע ואת תוצאות השימור בהקפאה. באופן כללי, איסוף 5 מ”ל של צרורות גמטה מעל 5 מ”ל מי ים (נפח כולל 10 מ”ל) יגרום לריכוז זרע של 2 × 109 תאים / מ”ל ומעלה, אך ישנם מקרים בהם ריכוז הזרע עשוי להיות נמוך יותר עקב הבדלים בין המינים או צרורות המתפרקים במהלך האיסוף. השימוש בקריודילואנט DMSO בריכוז גבוה יותר (30% v/v) מפחית את הכמות שבה הזרע מדולל כדי לסייע במזעור השונות בין אצווה לאצווה בריכוז הזרע בקריוביאלי. חשוב לציין כי השימוש ב-30% DMSO להשגת ריכוז ה-DMSO הסופי אינו משפיע על הפרמטרים של ריכוז או תנועתיות לאחר הפשרה, כפי שמוצג בנתונים המייצגים באיור 3. ההשוואה המתודולוגית השנייה מספקת חלופה לשקופיות תא ההחלקה החד-פעמיות המשמשות בדרך כלל עבור CASA. האתגר העיקרי בשימוש בשקופיות זמינות מסחרית לניתוח זרע אלמוגים הוא שהן יכולות להשפיע על הדיוק של הערכת תנועתיות עקב הידבקות הזרע לציפוי המגלשה. השימוש בפתרון ההפעלה מתגבר על בעיה זו בדוגמאות רבות אך לא בכולן, ולכן עדיין מומלץ לבצע ניתוח CASA נפרד לתנועתיות באמצעות שקופית רגילה כדי להבטיח אמינות ועקביות. השימוש בתא ספירה של מקלר מתגבר על הצורך לנתח ריכוז ותנועתיות בנפרד, ועשוי לשפר את הדיוק של מדידות הריכוז (איור 2), ולכן מומלץ להשתמש בו עם הפרוטוקול הנוכחי. בהינתן פער זה במדידות הריכוז, ממצא שדווח בעבר20, חשוב תמיד לרשום את פרטי השקף במסד הנתונים לצד נתוני איכות הזרע, ובמידת האפשר, להיות עקביים בסוג השקף התא המשמש למזעור השונות בין אצווה לאצווה ולסייע להבטיח חישובים אמינים של יחסי זרע: ביציות להפריה.

התהליך האוטומטי למחצה המתואר כאן מספק מסלול סטנדרטי ויעיל לשימור בהקפאה ובנקאות ביולוגית של זרע ממיני אלמוגים מאוימים תוך שמירה על הביטחון הביולוגי והאיכות של הדגימה. הפרוטוקול המתואר ניתן להעברה בקלות וזול יחסית ליישום בתוכניות ברחבי העולם הפועלות להבטחת מגוון האלמוגים הקיים באמצעות שימור בהקפאה, שיהיה חיוני למניעת הכחדות ולמקסום המשאבים הזמינים למאמצי שיקום שוניות בהווה ובעתיד.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לבעלים המסורתיים של Konomie, אנשי Woppaburra, על הרשות לנסות את המערכת המתוארת במאמר זה במהלך ההשרצה במדינה בנובמבר 2022, ולמרכז Konomie לחינוך סביבתי על השימוש במתקנים שלהם. ברצוננו גם להכיר בתמיכת צוות המכון האוסטרלי למדעי הים ומדענים שסייעו באיסוף והשרצה של מושבות בתוך סימולטור הים הלאומי. עבודה זו בוצעה כפעילות של תת-תוכנית השימור בהקפאה (RRAP-CP-01) עבור תוכנית השיקום וההסתגלות של השונית, שותפות בין קרן השונית של ממשלת אוסטרליה, וקרן שונית המחסום הגדולה, עם תמיכה נוספת מאגודת השימור טארונגה אוסטרליה, יוזמת המדע לשימור טארונגה ופילנתרופים אחרים התומכים בקרן טארונגה.

Materials

Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller – Aliquotting pipette Vistalab 2100-1005 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
5 mL serological pipettes (bulk) Thermo Scientific  Nunc 170355 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
10 mL serological pipettes (bulk) Thermo Scientific Nunc  170356 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
P2 0.2–2 µL pipettor Gilson F144054M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P10 1–10 µL pipettor Gilson F144055M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P20 2–20 µL pipettor Gilson  F144056M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P200 20–200 µL pipettor Gilson F144058M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P1000 100–1000 µL pipettor Gilson F144059M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
Vacuum pump Millipore WP6122050 Preparation of filtered sea water for solution preparation
Reusable bottle-top filtration system Thermo Scientific DS0320-5045 Preparation of filtered sea water for solution preparation
0.22-µm filter discs, mixed cellulose esters  Merck Millipore GSWP04700 Preparation of filtered sea water for solution preparation
Filtered sea water N/A – Base medium for sperm activation and cryoprotectant solutions
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 Cryoprotectant chemical used at a final concentration of 10% v/v in filtered seawater for sperm cryopreservation
Caffeine Sigma-Aldrich C0750 Used to activate sperm motility
BSA heat shock fraction Sigma-Aldrich A9647 Used to minimise sperm adherance to CASA well slides
15-mL tubes – racked Thermo Scientific 339651 Preparation of sperm activation solution
50-mL tubes racked Thermo Scientific 339653 For collection of gamete bundles and filtered sperm samples
Transfer pipettes Thermo Scientific Samco 202PK To aid collection of gamete bundles from the water surface
100-µm filter baskets Fisher Scientific 22363549 To exclude eggs during separation of the sperm sample
Eppendorf racks Interpath 511029 Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Eppendorf 1.5-mL tube Eppendorf 30120086 Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Glass coverslips 18×18 mm Brand 4700 45 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Plain glass slides, precleaned, 75×25 mm Corning 2947 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Haemocytometer Hausser Scientific 1492 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
CASA slides (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B) IMV Technologies 025107 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Makler sperm counting chamber (CASA) IVFStore SM-373 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
accu-bead® counting beads Hamilton-Thorne 710111 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
CASA system + laptop Hamilton Thorne Ceros II Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Safety Glasses Generic – Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Lab coat Long sleeve, full length – Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Cryogloves (pair) Tempshield Mid-Arm Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Medium forceps Generic – For removing cryopreserved samples from the cryo racks and manipulating samples in liquid nitrogen
Barcode scanner (2D compatible) Zebra DS2278 For reading 1D and 2D barcodes on cryovials for sample management
2.0-mL CryoStorage Vial, external thread, pre-capped, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), linear and human readable Eppendorf 30079434 Barcoded cryovials for cryopreservation of sperm samples
Cryovial rack Simport T315 Rack to hold cryovials, with locking base to allow for one hand de-capping and capping
Freezing racks Custom – Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing rack lid Custom – Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container Isosteel  VA-9683  Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Lab timers Generic – For timing of cryoprotectant equilibration prior to cryopreservation
Nitrogen bath 9L BelArt M16807-9104 For quenching samples during cryopreservaton and holding samples during sorting and handling
Thermocouple data logger- multichannel Omega HH520 Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Thermocouple probe – Type K Omega 5SC-TT-K-30-36 Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Cryo pens/coloured permanent pen Staedtler Lumocolor 318 Optional for marking cryovial lids to assist with sample management
Dry Shipper – charged Taylor Wharton CXR100, or CX500 For transfer of cryopreserved samples from field/collection sites to the biorepository for storage
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eakin, C. M., Sweatman, H. P. A., Brainard, R. E. The 2014-2017 global-scale coral bleaching event: Insights and impacts. Coral Reefs. 38 (4), 539-545 (2019).
  2. Anthony, K., et al. New interventions are needed to save coral reefs. Nature Ecology & Evolution. 1 (10), 1-3 (2017).
  3. Wildt, D. E. Genome resource banking for wildlife research, management, and conservation. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 41 (4), 228-234 (2000).
  4. Hagedorn, M., et al. Preserving and using germplasm and dissociated embryonic cells for conserving Caribbean and Pacific coral. PLoS ONE. 7 (3), e33354 (2012).
  5. Hagedorn, M., et al. First frozen repository for the Great Barrier Reef coral created. Cryobiology. 65 (2), 157-158 (2012).
  6. Zuchowicz, N., Daly, J., Lager, C., Williamson, O., Hagedorn, M. Freezing on the beach: A robust coral sperm cryopreservation design. Cryobiology. 101, 135-139 (2021).
  7. Hobbs, R. J., et al. A decade of coral biobanking science in Australia – transitioning into applied reef restoration. Frontiers in Marine Science. , 9 (2022).
  8. Daly, J., et al. Cryopreservation can assist gene flow on the Great Barrier Reef. Coral Reefs. 41, 455-462 (2022).
  9. Hagedorn, M., et al. Assisted gene flow using cryopreserved sperm in critically endangered coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (38), e2110559118 (2021).
  10. Daly, J., et al. Successful cryopreservation of coral larvae using vitrification and laser warming. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
  11. Daly, J., et al. The first proof of concept demonstration of nanowarming in coral tissue. Advanced Sustainable Systems. , (2023).
  12. Powell-Palm, M. J., et al. Cryopreservation and revival of Hawaiian stony corals via isochoric vitrification. Nature Communications. 14, 4859 (2023).
  13. . Reef Restoration and Adaptation Program Available from: https://gbrrestoration.org (2023)
  14. . Florida Coral Rescue Available from: https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue (2023)
  15. Harrison, P. L. . Coral reefs: An ecosystem in transition. , 59-85 (2011).
  16. Hagedorn, M., Carter, V. L. Cryobiology: Principles, species conservation and benefits for coral reefs. Reproduction, Fertility and Development. 28 (8), 1049 (2016).
  17. Zuchowicz, N., et al. Assessing coral sperm motility. Scientific Reports. 11, 61 (2021).
  18. Thomas, D. Evaluation of an automated cryovial dispensing system for cell banking. Genetic Engineering & Biotechnology News. 37 (17), 22-23 (2017).
  19. . Coral cryopreservation training course Available from: https://nationalzoo.si.edu/center-for-species-survival/coral-cryopreservation-training-course (2023)
  20. Bailey, E., et al. Validation of sperm counting methods using limits of agreement. Journal of Andrology. 28 (3), 364-373 (2007).
  21. Hu, E., Yang, H., Tiersch, T. R. High-throughput cryopreservation of spermatozoa of blue catfish (Ictalurus furcatus): Establishment of an approach for commercial-scale processing. Cryobiology. 62 (1), 74-82 (2011).
  22. Pickett, B. W., Berndtson, W. E. Preservation of bovine spermatozoa by freezing in straws: A review. Journal of Dairy Science. 57 (11), 1287-1308 (1974).
  23. Westbrook, C. E., Daly, J., Bowen, B., Hagedorn, M. Cryopreservation of the collector urchin embryo, Tripneustes gratilla. Cryobiology. 15, 104865 (2024).
  24. Maria, A. N., et al. Use of cryotubes for the cryopreservation of Tambaqui fish semen (Colossoma macropomum). Cryobiology. 70 (2), 109-114 (2015).
  25. Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreservation & Biobanking. 21 (1), 106-110 (2023).

Tags

Coral CryopreservationSperm CryopreservationBiobankingCoral Reef RestorationSemi-automated WorkflowComputer-assisted Sperm AnalysisMetadata ManagementGenetic DiversityAquacultureReef Adaptation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Daly, J., Hobbs, R., Zuchowicz, N., Hagedorn, M., O’Brien, J. K. A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture. J. Vis. Exp. (208), e66233, doi:10.3791/66233 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image