JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Biyobankacılık ve su ürünleri yetiştiriciliğini desteklemek için mercan spermlerinin dondurularak saklanması için yarı otomatik bir iş akışı

Published: June 07, 2024
doi:
10.3791/66233
, , , ,
1Taronga Institute of Science and Learning,Taronga Conservation Society Australia, 2School of Biological, Earth and Environmental Sciences,University of New South Wales, 3Department of Mechanical Engineering,University of Minnesota, 4Hawaii Institute of Marine Biology,University of Hawaii, 5Smithsonian National Zoo and Conservation Biology Institute

Summary

Bu protokol, genetik çeşitliliği güvence altına almayı ve resif restorasyon çabalarını desteklemeyi amaçlayan, tehdit altındaki mercan türlerinden spermin işlenmesi ve dondurularak saklanmasının verimliliğini ve kapasitesini artırmak için yarı otomatik bir yolu tanımlar.

Abstract

Mercan resifleri, okyanus ısınmasının neden olduğu ağartma olaylarının sıklığı arttıkça bir krizle karşı karşıya kalıyor ve bu da dünyanın dört bir yanındaki resiflerdeki mercanların ölümüne neden oluyor. Daha sonra genetik çeşitlilik ve biyolojik çeşitlilik kaybı, mercanın değişen iklime uyum sağlama yeteneğini azaltabilir, bu nedenle mevcut çeşitliliği koruma çabaları, şimdi ve gelecekte resif restorasyonu için mevcut kaynakları en üst düzeye çıkarmak için çok önemlidir. Genetiği uzun vadede güvence altına almak için en etkili yaklaşım, canlı numunelerin kriyojenik sıcaklıklarda sıvı nitrojen içinde süresiz olarak dondurularak saklanmasına izin veren kriyoprezervasyon ve biyobankacılıktır. Mercan sperminin dondurularak saklanması 2012’den beri mümkün olmuştur, ancak mercan üremesinin mevsimsel doğası, biyo-bankacılık faaliyetlerinin yumurtlama meydana geldiğinde yılda sadece birkaç gece ile sınırlı olduğu anlamına gelir. Bu nedenle, mercan sperm işleme ve kriyoprezervasyon iş akışlarının verimliliğini artırmak, bu sınırlı biyobankacılık fırsatlarını en üst düzeye çıkarmak için çok önemlidir. Bu amaçla, mevcut teknolojiler üzerine inşa ederek ve mercan sperminin değerlendirilmesini, işlenmesini ve dondurularak saklanmasını kolaylaştırmak için yarı otomatik bir yaklaşım oluşturarak mercan spermi için kriyoprezervasyon işleme yollarını optimize etmek için yola çıktık. Bilgisayar destekli sperm analizini, barkodlu kriyoviyalleri ve birden fazla kullanıcı tarafından aynı anda düzenleme için bir dizi bağlantılı otomatik veri sayfasını birleştiren süreç, sahada hem numune işlemenin hem de meta veri yönetiminin verimliliğini artırır. Avustralya’daki Resif Restorasyonu ve Adaptasyon Programı gibi kesişen araştırma programlarıyla entegrasyon yoluyla, kriyoprezervasyon, su ürünleri yetiştiriciliği popülasyonlarının genetik yönetimini kolaylaştırarak, termal toleransı artırmaya yönelik araştırmaları destekleyerek ve mercan türlerinin neslinin tükenmesini önleyerek büyük ölçekli resif restorasyon programlarında çok önemli bir rol oynayabilir. Açıklanan prosedürler, dünya çapındaki resiflerde mercan kriyoprezervasyonu ve biyobankacılık uygulayıcıları için kullanılacak ve kriyoprezervasyon teknolojilerinin araştırma laboratuvarlarından büyük ölçekli uygulamalara geçişi için bir model sağlayacaktır.

Introduction

Mercan resifleri küresel olarak, iklim değişikliğinin neden olduğu okyanus ısınması ve asitlenme nedeniyle mercan türleri, popülasyonları ve genetik çeşitlilik kaybı yaşıyor, bu kritik habitatların yaşayabilirliğini azaltıyor ve destekledikleri türleri etkiliyor 1,2. Genetiği uzun vadede güvence altına almak için en etkili yaklaşım, canlı numunelerin kriyojenik sıcaklıklarda sıvı nitrojen içinde süresiz olarak dondurularak saklanmasına izin veren kriyoprezervasyon ve biyobankacılıktır3. 2012 yılında mercan sperminin4 dondurularak saklanması için yöntemlerin geliştirilmesi, ilk kez bu türlerden elde edilen genetiğin biyobankacılığını mümkün kıldı ve 2012 yılında mercan genetiği için ilk biyolojik deponun geliştirilmesine yol açtı5. O zamandan beri, bu kriyoprezervasyon protokolü daha da rafine edildi6 ve dünya çapında 50’den fazla mercan türünün genetiğini güvence altına almak için kullanıldı ve bu türlerin 30’u Avustralya’daki Büyük Set Resifi’ndengeliyor 7. Dondurularak saklanmış mercan spermi, normal olarak gelişen ve Avustralya8 ve Karayipler’de 9 yardımcı gen akışı deneylerini kolaylaştırmak için kullanılan sağlıklı mercanlarüretebilir. Larvalar 10 ve yetişkin mercan dokuları11,12 gibi karmaşık doku tiplerinin dondurularak saklanmasını sağlamak için teknolojiler şu anda geliştirilme aşamasındayken, mercan sperminin dondurularak saklanması şu anda mercan genetiğinin rutin biyobankacılığı için mevcut olan en yaygın araçtır.

Mercan popülasyonları üzerindeki etkiler arttıkça, birçok ülke resif restorasyonunu ve adaptasyonunu desteklemek (örneğin, Avustralya’daki Resif Restorasyon ve Adaptasyon Programı [RRAP]13) veya kalan tehlike altındaki mercan popülasyonlarını güvence altına almak (örneğin, ABD’deki Florida Coral Rescue14). Bu programlar bağlamında, kriyoprezervasyon, mevcut genetik çeşitliliği güvence altına almanın ve yok oluşları önlemenin yanı sıra araştırma ve büyük ölçekli mercan üretimini destekleyen bir teknoloji olarak düşünülebilir. Sperm kriyoprezervasyonu, fiziksel veya zamansal olarak ayrılmış popülasyonlar arasında üreme üzerinde daha fazla kontrol sağlayabilir ve anaçların genetik yönetiminin termal tolerans veya hastalık direnci gibi arzu edilen özellikleri seçmesine izin verebilir8. Bugüne kadar, mercan sperm biyobankacılığı, biyoçeşitlilik yönetimini desteklemek için nispeten küçük bir ölçekte gerçekleştirilmiştir7, bu nedenle, bu tür bir biyobankacılığın bu daha büyük resif restorasyon programları içindeki potansiyelini karşılaması için bir miktar yükseltme gerekecektir. Mercan üremesine dayalı tüm resif restorasyon çabalarında olduğu gibi, biyo-bankacılık çabalarının artmasının önündeki ana engel, mercan gametlerinin mevcut olduğu sınırlı dönemdir, çünkü resif oluşturan türlerin çoğunda yumurtlama, ilkbaharın sonlarında ve yazın başlarında dolunaya denk gelir15, yani gametlerin her yıl yalnızca birkaç gece kriyoprezervasyon ve biyobankacılık için mevcut olduğu anlamına gelir. Ayrıca, kitlesel yumurtlamanın meydana geldiği bölgelerde, örneğin Büyük Set Resifi’nde, tipik olarak aynı gece aynı anda veya birkaç saat içinde yumurtlayan birden fazla tür vardır15. Bu nedenle, numunelerin ve ilgili meta verilerin bütünlüğünü sağlarken, bu kısa yıllık yumurtlama pencereleri sırasında biyobankacılık kapasitesini en üst düzeye çıkarmak için işlemenin ölçeğini ve verimliliğini artırmak için sperm kriyoprezervasyon yolunda iyileştirmeler yapılması gerekmektedir.

Mercan sperminin dondurularak saklanması ve biyobankacılığı, yumurtlama sırasında gametlerin toplanmasından örneklerin biyodepoya ve veri tabanına katılmasına kadar birkaç önemli adımı içerir (Şekil 1). İşlem, spermin yumurtalardan ayrılması (hermafrodit türlerde) veya su kolonundan (gonokorik türlerde) spermin toplanması ile başlar, ardından sperm hareketliliği ve konsantrasyonunun değerlendirilmesi ile devam eder. Sperm daha sonra filtrelenmiş deniz suyunda (FSW) kriyoprotektan (% 10 v / v nihai konsantrasyon, dimetil sülfoksit, DMSO) ile birleştirilir ve özel olarak tasarlanmış bir soğutma cihazında -20 ° C / dk’da soğutulur4. Bu işlemin erken yinelemeleri, faz kontrast mikroskobu ve hemositometre sayımları yoluyla sperm hareketliliği ve konsantrasyonunun görsel değerlendirmesine, numuneler kriyoprezervasyon için işlenirken tüplerin yazdırılmasına ve etiketlenmesine, sperm örneklerinin kriyoviyallere elle pipetlenmesine ve özel olarak tasarlanmış bir yüzer raftasoğutulmasına dayanıyordu 16. Bilgisayar destekli sperm analizinin (CASA) uygulanması17 ve 3D baskılı bir soğutma cihazının6 geliştirilmesi, mercan sperm kriyoprezervasyonunun verimliliğini ve güvenilirliğini artırmıştır, ancak sperm örneği işleme yolu, başlangıcından bu yana büyük ölçüde aynı kalmıştır. Bu yaklaşım, bir yumurtlama gecesinde orta sayıda koloni ve türden alınan numunelerin işlenmesi için uygun olsa da, büyük hacimler ve sayıda koloniler için (örneğin, bir seferde >10 koloniden alınan bireysel numuneler), kriyoprezervasyon yolunda, numune doğurganlık potansiyelinde bozulma olmadan numunelerin zamanında (yani sperm salınımından sonraki 2 saat içinde) işlenmesini engelleyen darboğazlar vardır. Kriyoviyaller için büyük ölçekli sıvı taşıma sistemleri mevcut olmasına rağmen (örneğin, Thomas ve ark.18), bunlar tipik olarak büyük parti işleme (yani, birden fazla kriyovial rafı) için tasarlanmıştır ve sahada nakliye ve kullanım için uygun değildir, bu nedenle bu uygulama için uygun maliyetli değildirler. Bu nedenle, bu çalışma, bir yumurtlama gecesinde etkili bir şekilde kriyoprezerve edilebilecek numune sayısını en üst düzeye çıkarmak için işleme yolundaki kilit adımlarda taşınabilir, ucuz otomasyon ekipmanı ve yöntemleri sunarak mercan sperminin kriyoprezervasyonunun verimliliğini artırmayı amaçlamıştır.

Protocol

Burada açıklanan yöntemler, hem hermafroditik hem de gonokorik mercan türlerinden spermleri işlemek ve kriyoprezervasyon yapmak için kullanılabilir. Her iki üreme modu için sperm kriyoprezervasyonu için mercan yumurtlaması ve gamet toplama hakkında genel bir giriş ve astar, Smithsonian Ulusal Hayvanat Bahçesi ve Koruma Biyolojisi Enstitüsü Mercan Kriyoprezervasyon Eğitim Kursu19’da bulunabilir. Açıklanan yöntemler öncelikle Woppaburra Deniz Ülkesi’ndeki Keppel Adası grubundan ve Avustralya’daki Büyük Set Resifi’ndeki Bindal Deniz Ülkesi’ndeki Davies Resifi’nden toplanan Acropora millepora kolonilerinden elde edilen gametler kullanılarak geliştirilmiştir. Mercanların ve gametlerin tüm toplanması ve kullanımı, ilgili Deniz Ülkelerinin Geleneksel Koruyucularının önceden ve bilgilendirilmiş rızası ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 1. Yumurtlama öncesi – sistem kontrolleri ve sperm aktivasyon çözeltisi ve kriyodilüslüentin hazırlanması Barkod tarayıcının şarjlı, etkin olduğunu onaylayın ve elektronik tablo verilerini yatay hücre girişi olarak girecek şekilde ayarlayın. Bu ayarı özelleştirmek için barkod okuyucu kullanım kılavuzuna bakın. CASA için mercan sperm aktivasyonu konsantre stok çözeltileri hazırlayın.NOT: Aktivasyon çözeltisinin hazırlanması için kimyasallarla çalışırken tek kullanımlık eldivenler giyilmelidir.37 ° C’ye ayarlanmış bir tüp ısıtıcısı yardımıyla 4 mL steril saflaştırılmış doku kültürü suyunda 1.5 g BSA’yı çözerek veya tüpü kapalı ellerde tutarak, periyodik olarak hafifçe döndürerek (şişeyi sallamayın) % 30 sığır serum albümini (BSA) stok çözeltisi (5 mL) hazırlayın. Çözeltiye girdikten sonra, doku kültürü suyu kullanarak son hacme (5 mL) kadar yapın, tüpü tarihle etiketleyin ve “H2O’da% 30 BSA” olarak işaretleyin. Buzdolabında (4 °C) 2 haftaya kadar saklayın. 0.2913 g kafeini 24 mL filtrelenmiş deniz suyunda (FSW) çözerek 60 mM kafein stok çözeltisi (25 mL) hazırlayın. Çözeltiye girdikten sonra, FSW kullanarak son hacme (25 mL) kadar tamamlayın, tüpü tarihle etiketleyin ve “FSW’de 60 mM kafein” olarak işaretleyin. Buzdolabında 1 aya kadar saklayın.NOT: FSW’de kafeinin maksimum çözünürlüğü yaklaşık 71 mM’dir. ~ 109 sperm / mL’de (FSW’de% 0.9 BSA + 12 mM kafein) sperm örnekleri için sperm aktivasyon çalışma solüsyonu hazırlayın.10 mL çalışma çözeltisi için, 2.0 mL 60 mM kafein stok çözeltisi + 0.3 mL BSA stok çözeltisi + 7.7 mL FSW’yi birleştirin. Tüpü tarih ve “sperm aktivasyon çalışma solüsyonu -% 0.9 BSA + 12 mM kafein” ile etiketleyin. Her kullanım gününde hazırlayın, oda sıcaklığında (19-30 °C) saklayın ve günün sonunda kullanılmayan solüsyonu atın. Kriyoprotektan çözeltileri (kriyodilentler) hazırlayın. Kriyoprotektan DMSO’yu kullanırken tek kullanımlık eldivenlerin giyildiğinden emin olun.NOT: FSW, bir numune içindeki ilk sperm konsantrasyonuna ve kriyoprezerve alikotların istenen nihai sperm konsantrasyonuna bağlı olarak değişen kriyoprotektan konsantrasyonları ile hazırlanır. Kriyoseyrelticiyi hazırlarken, DMSO ilavesinden önce FSW’nin 50 mL’lik tüpe aktarıldığından emin olun.Yumurtlamadan önce mercanların tutulduğu tank sisteminden ham deniz suyunu toplayın (~ 35 ppt tuzluluk). Ham deniz suyunu, 0,2 μm pirojenik olmayan membran filtre takılı bir vakum pompasına bağlı bir şişe üstü filtreleme sistemi kullanarak filtreleyin. ≥2 × 109 sperm / mL için, 50 mL’lik bir tüpte 10 mL DMSO + 40 mL FSW’yi birleştirerek FSW’de% 20 DMSO hazırlayın. Sperm konsantrasyonu <2 × 109 sperm / mL için, 50 mL’lik bir tüpte 15 mL DMSO + 35 mL FSW’yi birleştirerek FSW’de% 30 DMSO hazırlayın. Tüpü tarih ve DMSO konsantrasyonu ile etiketleyin, yani DMSO veya DMSO. Her kullanım gününde hazırlanın, oda sıcaklığında (19-30 °C) saklayın ve her günün sonunda kullanılmayan solüsyonu atın.NOT: DMSO ve FSW’nin karıştırılması ekzotermik bir reaksiyon oluşturur ve oda sıcaklığına soğumaya izin vermek için kriyodilasyon kullanımdan çok önce yapılmalıdır. FSW, bu ısı oluşumunu dengelemek için kriyodiyülüentin hazırlanması için 4 °C’de saklanabilir. Termokupl veri kaydediciyi hazırlayın.Her bir kriyoprezervasyon çalışmasının yaklaşık soğutma hızını ölçmek için, FSW’ye DMSO içeren bir kriyoviyal yerleştirin ve kapaktan bir termokupl probu sokularak sperm numunelerinin yanında kriyoprezervasyon rafının bir numune yuvasına yerleştirin. Bir termokupl şişesi yapmak için, barkodlu kriyoviyalin kapağında küçük bir delik açın veya eritin ve açıklıktan K tipi veya T tipi bir termokupl yerleştirin. Termokupl prob ucunu, flakon doldurulduğunda numunenin ortasına oturacak şekilde bir seviyeye kadar aşağı itin ve iç flakon duvarı ile teması önlemek için prob ucunu flakonun ortasında tutun. Kapağı kapatın ve termokupl probunu sıcak tutkalla yerinde tutun. Tek kullanımlık eldivenler giyerek, barkodlu kriyoviali FSW’de kriyoprezervasyon yapılacak sperm örneğinin hacmine eşit% 10 DMSO’luk bir hacimle doldurun. FSW’de taze% 10 DMSO hazırlayın ve termokupl şişelerini günlük olarak doldurun. 2. Sperm hazırlama ve değerlendirme Hermafrodit türler için (örneğin, Acropora türleri), 3 mL’lik bir transfer pipeti kullanarak su yüzeyinden gamet demetleri toplayın ve bunları 5 mL deniz suyu (10 mL toplam hacim) üzerinde 5 mL gamet demeti oranında etiketli 50 mL’lik bir tüpe yerleştirin. Gonokorik türler için, 3 mL’lik bir transfer pipeti kullanarak polip ağzına yakın bir yerden sperm toplayın ve numuneyi etiketli 50 mL’lik bir tüpe yerleştirin, ardından doğrudan adım 2.8’e geçin.NOT: Gamet örneklerinin toplanması ve işlenmesi için tek kullanımlık eldivenler gerekli değildir, ancak tercih edilirse giyilebilir. Çapraz kontaminasyonu önlemek için eller tatlı su ile iyice yıkanmalı veya her gamet örneği arasında eldivenler değiştirilmelidir. Hermafrodit türler için, demetler parçalanana kadar numuneyi elinizle hafifçe döndürerek sperm-yumurta demetlerini çalkalayın.NOT: Bazı Montipora türlerinin yumurtalarında bir toksin vardır, bu nedenle spermlere zarar vermemek için minimum çalkalama ile yavaşça parçalanmalarına izin verilmelidir. Yumurtaların yüzeye çıkmasına ve spermin yerleşmesine izin vermek için numuneyi bir tüp rafında 2 dakika bekletin (yumurtalar yüzeyde pembe/kahverengi bir tabaka oluşturacak ve tek tek yumurtalar görünecektir; bkz. Şekil 1i). Spermi ayırmak ve kontamine yumurtaları çıkarmak için, 3 mL’lik temiz bir transfer pipeti kullanarak spermi tüpün altından nazikçe aspire edin. Sperm örneğini, yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpünün üzerine oturan 100 μm’lik bir hücre süzgecine aktarın. Numune filtreden kolayca akmalıdır. Numune akışını teşvik etmek için filtreye hafifçe vurun ve gerekirse, filtrenin alt tarafından kalan numuneyi toplamak için temiz bir transfer pipeti kullanılabilir. Filtreyi çıkarın, ardından hava değişimine izin vermek için tüpü gevşek bir şekilde kapatın. Filtrelenmiş sperm örneğini koloni kimliği ile etiketleyin ve örneği sperm değerlendirme iş istasyonuna taşıyın. Mercan biyo-bankacılık otomatik veri sayfası dosyasını açın (Ek Dosya 1). Sperm değerlendirme sekmesinde mercan kolonisi meta verilerini girin (AH sütunları). CASA değerlendirmesi için sperm hazırlayın.Sperm örneğini iyice karıştırın ve 10 μL’lik bir alikotu boş bir 1.8 mL mikrosantrifüj tüpüne çıkarın. Hemen 10-20 saniye boyunca damla damla 0.390 mL sperm aktivasyon çalışma solüsyonu ekleyin, spermi solüsyona hafifçe karıştırın. Bu, ham sperm konsantrasyonu ~ 2 × 10 9sperm / mL ise CASA değerlendirmesi (~ ×50 106 / mL) için uygun bir konsantrasyon sağlayan (sperm: çözelti, v / v) (veya seyreltme faktörü 40) bir seyreltme oranı verir. Tüpü 5 kez ters çevirin ve solüsyonu tüpün dibine oturtmak için açmadan önce tüp kapağını hafifçe vurun.NOT: CASA için sperm konsantrasyonu, doğru sperm takibine izin vermek için 8-50 × 106 / mL aralığında olmalıdır17. Gerekirse konsantrasyonu azaltmak için ham sperm alikotuna ek sperm aktivasyon çalışma solüsyonu eklenebilir. Seyreltme oranını yeniden hesaplayın ve bu değeri elektronik tabloya girin. Birçok numunenin aynı anda işlenmesi gereken durumlarda, 1.8 mL mikrosantrifüj tüpleri, doğrudan üzerine eklenen 10 μL sperm numunesi alikotu ile 0.390 mL sperm aktivasyon çalışma solüsyonu ile önceden yüklenebilir, daha sonra tüpü 10× ters çevirerek ve açmadan önce tüp kapağını hafifçe vurarak iyice karıştırılabilir. Zuchowicz ve ark.17’de tarif edildiği gibi bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) kullanarak, bir Makler sayma odasına20 4 μL aktive sperm süspansiyonu yerleştirerek veya Hagedorn ve ark.4’te tarif edildiği gibi faz kontrast mikroskobu altında görsel değerlendirme ve hemositometre sayımı ile sperm hareketliliğini ve aktive edilmiş numunenin konsantrasyonunu değerlendirin.NOT: Makler haznesi ve lamel etanol, ardından damıtılmış su ile iyice temizlenmeli ve numuneler arasında tüy bırakmayan bir mendil ile silinmelidir. CASA değerlendirmesi için kullanılan sperm seyreltme faktörünü girin ve sperm konsantrasyonu (milyon/mL), toplam motilite (%) ve progresif motilite (%) için CASA çıkışlarını otomatik veri sayfasına girin.NOT: Ortalama yol hızı (VAP), düz çizgi hızı (VSL) ve eğrisel hız (VCL) dahil olmak üzere ek CASA ölçümleri isteğe bağlı olarak otomatik veri sayfasına dahil edilebilir veya daha sonra kaydedilen CASA dosyalarından alınabilir. Sperm konsantrasyonunu filtrelenmiş sperm örneği tüpüne yazın ve örneği, demet parçalanması ve işlenmesiyle aynı sırayla kriyoprezervasyon iş istasyonuna aktarın. 3. Sperm seyreltme ve kriyoprotektan dengesi Kriyoprezervasyon iş istasyonunda, sperm değerlendirme iş istasyonunun kullandığı aynı mercan biyo-bankacılık otomatik veri sayfası dosyasını açın ve Kriyoprezervasyon sekmesini seçin. Sperm örnek tüpü etiketini kontrol edin ve Koloni Kimliğini (sütun C) kontrol ederek ilgili girişi tanımlayın. İş istasyonları arasında aynı otomatik veri sayfası dosyasına aynı anda erişilmiyorsa, verileri otomatik veri sayfasındaki Koloni Kimliğine (sütun C) ve sperm konsantrasyonuna (sütun F) manuel olarak girin. Serolojik bir pipet kullanarak, numuneyi pipete çekerek ve aynı tüpe geri atarak sperm numunesi hacmini ölçün; E sütunundaki değeri girin. Gerekli kriyoprotektan konsantrasyonu için otomatik hesaplanan sütun I’i ve eklenecek kriyofiltre hacmi için sütun H’yi kontrol edin (Tablo 1). 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın ve serolojik bir pipet kullanarak, numuneyi sürekli ve nazikçe karıştırarak kriyodilüteni damla damla eklemeye başlayın ve DMSO kullanımı için tek kullanımlık eldivenlerin giyildiğinden emin olun. P sütununda kriyoseyreltici ekleme süresini kaydedin. Sperm konsantrasyonu Kriyoseyreltici Seyreltme oranı (sperm:kriyodilüent) Sperm örneğindeki son DMSO konsantrasyonu (%) < 2 × 109/mL FSW’de DMSO 2:1 10% ≥ 2 × 109/mL FSW’de DMSO 1:1 10% Tablo 1: Kriyoprezervasyon yapılacak numunedeki toplam sperm konsantrasyonunun değerlendirilmesine dayalı olarak, mercan sperminin dondurularak saklanması için kriyoseyrelt konsantrasyonu ve seyreltme oranları. 4. Sperm kriyoprezervasyonu Kaç tane kriyoviyalin doldurulacağını belirlemek için K sütununu okuyun. Bu, toplam sperm hacminden ve flakon başına istenen hacimden (çoğu durumda 1 mL) otomatik olarak hesaplanır. 10 dakikalık kuluçka süresi boyunca, 4.2 ila 4.6 arasındaki adımlarla ilerleyin. Steril barkodlu kriyoviallerin kapağını açın ve kapakları temiz/steril bir yüzeye yerleştirin. İsteğe bağlı: Kalıcı bir işaretleyici kullanarak her kriyoviyal üzerine # çalışmasını yazın; Bu, biyobankaya erişim için hızlı numune tanımlamasına yardımcı olabilir. İstenen numune hacmine (1 mL) ayarlanmış bir serolojik pipet ve alikot edici bir pipetleyici kullanarak, numuneleri kapaksız barkodlu kriyoviyallere ve rekapaj şişelerine ayırın. Bir termokupl şişesini ve tüm dolu numune şişelerini oda sıcaklığında boş bir kriyo rafına yerleştirin. Tüm şişelerde barkodlu yüzeyin dışa baktığından emin olun. Gerekirse, tüm boşlukların dolu olduğundan emin olmak için kriyo rafındaki herhangi bir boş alana FSW’de DMSO içeren ek sahte kriyoviyaller yerleştirin. Çalışma numarasını otomatik veri sayfasına (U sütunu) girin ve kriyo rafı seri numarasını (QR kodu) V sütununa tarayın. İmleci Z sütununun doğru hücresine yerleştirin ve termokupl şişesini tarayın, ardından rafa yüklenen tüm kriyoviyal tüpleri (AA sütunundan itibaren) tarayın. Numunenin şişenin dişine girmediğinden emin olmak için rafı yan yatırmaktan kaçının. Tarama sırasında, verilerin doğru hücreye girildiğini ve tüm kriyoviyallerin bir kez tarandığını çapraz kontrol edin. Kriyoprotektan dengeleme süresinin geri kalanı için yüklenmiş ve taranmış rafları bir kenara koyun ve soğutma kabını kriyoprezervasyon için hazırlayın. Kriyo raf soğutma kabını, yaklaşık -20 °C/dk’da soğutma için gerekli olan önceden belirlenmiş uygun seviyeye kadar sıvı nitrojen ile doldurun.NOT: Boğulma riski olduğundan nitrojen sadece iyi havalandırılan alanlarda kullanılmalıdır. Sıvı nitrojenle çalışırken kapalı burunlu ayakkabılar, koruyucu gözlükler/yüz siperleri ve kriyo eldivenler giyilmelidir. Sıvı nitrojen kullanımı ve kullanımı hakkında özel bilgiler için kurumsal yönergelere bakın. 10 dakikalık kriyoprotektan dengeleme süresinin sonunda, termokupl probunu veri kaydediciye bağlayın ve kayda başlayın, ardından dolu kriyo rafını yavaşça soğutma kabına yerleştirin ve kapağı uygulayın. Başlangıç zamanını Q sütununa kaydedin. Termokupl şişesi veri kaydedicide -80 °C veya altında okuduğunda, kriyo raf ekini polistiren kutu gibi ayrı bir kapta sıvı nitrojen banyosuna aktararak numuneleri sıvı nitrojen içinde söndürün. Kriyovialleri raftan çıkarın ve biyodepoya taşınmak üzere kuru bir nakliyeciye aktarın.

Representative Results

Bu protokolde özetlenen adımlar, Hagedorn ve ark.4 tarafından tanımlanan mercan spermi kriyoprezervasyonu için orijinal yöntemlere ve ardından Zuchowicz ve ark.6 tarafından yapılan iyileştirmelere dayanmakta ve kriyoprezervasyon ve biyobankacılık için sperm işlemenin verimliliğini artırmak için önemli iyileştirmeler sağlamaktadır. Barkodlu kriyoviallerin ve alikotasyon yapan bir otomatik pipetleyicinin kullanılması, kriyoviyalleri yazdırma ve elle etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırarak sperm paketleme prosedürünü basitleştirir ve çok sayıda numuneyi elle pipetleme zorluğunu azaltır. Daha da önemlisi, bu iyileştirmeler kriyoprezervasyon için numune hazırlama için gereken süreyi yaklaşık 8-10 dakikadan 5 dakikanın altına düşürür. CASA’nın kullanımıyla birlikte, bu iyileştirmeler, mercan sperminin verimli biyobankacılığı için gereken personel sayısını, orijinal yöntemlerde 4’ten 6’ya, mevcut protokolü kullanan iki kişiye kadar azaltmaktadır. Ek olarak, barkodlu kriyoviyallerin kullanılması, her tüpün benzersiz bir tanımlayıcıya sahip olduğu anlamına gelir, bu nedenle her biri, toplu olarak yazdırılan etiketler kullanılarak önceki yöntemden daha yüksek çözünürlükle veritabanı içinde izlenebilir. Avustralya’daki 2022 Great Barrier Reef yumurtlama sezonu sırasında protokolün iki yumurtlama olayında saha testi, iki operatör (CASA için bir kişi, kriyoprezervasyon için bir kişi) tarafından 5 türdeki 57 koloniden 389 numunenin dondurularak saklanması ve biyobankacılığı ile sonuçlandı. Avustralya, Queensland’deki Konomie’de (Kuzey Keppel Adası) Kasım 2022’de yapılan yumurtlama olayı sırasında, 24 Acropora millepora kolonisinden 150 numune, 2 saatlik bir süre boyunca iki operatör tarafından dondurularak saklandı. Bu kadar çok sayıda mercan kolonisinden alınan bu hacimdeki numunelerin verimli bir şekilde işlenmesi ve dondurularak saklanması, öncelikle numune hazırlama süresinde elde edilen verimlilikler ve iş istasyonları arasında basitleştirilmiş meta veri aktarımı ile sağlandı. Aralık 2023’te yumurtlama sırasında iş akışının daha fazla test edilmesi, mercan spermi için Makler sayma odasının, CASA sistemlerinde yaygın olarak kullanılan, ticari olarak mevcut sabit lamel tek kullanımlık hazne slaytlarına kıyasla daha doğru motilite ve konsantrasyon verileri sağladığını belirledi. Makler sayma odası, 4 μL numune hacmi ve mercan spermi için kullanılan standart CASA ayarları17 ile bilinen bir konsantrasyonda ticari olarak temin edilebilen lateks mikro boncuklar kullanılarak CASA için doğrulanmıştır. Bu analizler, üretici tarafından sağlanan beklenen konsantrasyon aralığına (46.0 ila 7.0 milyon / mL) düşen düşük değişkenliğe (44.5 ±± 0.7 milyon / mL) sahip tutarlı sayımlar gösterdi (Şekil 2). Makler sayma odası ve sabit lamel odası slaytları kullanılarak toplanan Acropora millepora için CASA verilerinin karşılaştırılması, iki oda tipi arasında sperm konsantrasyonu sayımlarında önemli bir fark buldu (P = 0.002; Şekil 2), Makler sayma odası kullanılarak belirlenen konsantrasyonun yarısından daha azını kaydeden sabit lamel haznesi kızakları ile. Bu eğilim, diğer iki mercan türünden alınan sperm örneklerinde de gözlenmiştir (veriler gösterilmemiştir). Aralık 2023’te yapılan testlerde ayrıca, DMSO ile 1:1 seyreltme veya DMSO ile 1:2 seyreltme (sperm: kriyodilüs) kullanılarak dondurularak saklanan örneklerde toplam, hareketli veya aşamalı olarak hareketli spermlerin çözülme sonrası konsantrasyonlarında önemli bir fark bulunmadı (Şekil 3). Şekil 1: Kriyoprezervasyon için mercan sperminin yarı otomatik işlenmesi için kullanılan iş akışı ve sahada kullanılan mobil ekipman örnekleri. (A) Mercan gamet demetleri, 5 mL FSW üzerinde 5 mL demetler oranında toplanır ve yumurtaları ve spermleri ayırmak için parçalanır (i). Koloni meta verileri otomatik veri sayfasına (ii) girilir ve izole edilen sperm örneği bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) (iii) kullanılarak değerlendirilir. FSW’de (iv) veya DMSO ilavesini hesaplamak için sperm kalitesi parametreleri otomatik veri sayfasına eklenir ve seyreltilmiş numune barkodlu kriyoviyallere (v) ayrılır. Kriyovialler kriyo rafına yüklenir ve otomatik veri sayfasına (vi) taranır, ardından -20 °C/dk ila -80 °C (vii) hızında soğutulur. Numuneler daha sonra sıvı nitrojen içinde söndürülür ve Taronga CryoDiversity Bank’a (viii) taşınmak üzere kuru nakliyecilere aktarılır. (B) Konomie Çevre Eğitim Merkezi’ndeki sınıfta uzak bir saha sahasında kurulan CASA (solda) ve kriyoprezervasyon (sağda) istasyonlarının örneği. (C) Avustralya Deniz Bilimleri Enstitüsü Ulusal Deniz Simülatörü’nde birden fazla kriyo rafını çalıştırmak üzere kurulan laboratuvar tabanlı yüksek kapasiteli kriyoprezervasyon istasyonu örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Mercan sperm konsantrasyonunun ölçümü için iki farklı oda slayt seçeneğinin karşılaştırılması. (A) Acropora millepora’da (n = 3 kişi) toplam sperm konsantrasyonu ölçümlerinin Makler sayma odası ve ticari olarak temin edilebilen sabit lamel odası slaytları kullanılarak karşılaştırılması. Sütunlar ortalama ± SEM’i gösterir; yıldız işaretleri önemli bir farkı gösterir (P = 0.002). (B) Mercan spermi için bilinen bir konsantrasyonda ve standart CASA ayarlarında ticari olarak temin edilebilen lateks mikro boncuklar kullanılarak Makler sayma odasının doğrulanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Dondurularak saklanmış örneklerde toplam, hareketli veya aşamalı olarak hareketli spermin çözülme sonrası konsantrasyonları. Kriyoprezervasyon için nihai% 10 DMSO konsantrasyonunu elde etmek için FSW’de% 20 veya% 30 DMSO kullanılarak toplam, hareketli ve aşamalı olarak hareketli sperm konsantrasyonlarının çözülme sonrası karşılaştırmaları. N = 3 bireyden alınan numuneler, her biri 2 alikota bölündü, bir alikot% 20 DMSO ilavesiyle 1: 1 kriyoprezervasyon ile kriyoprezerve edildi ve ikinci alikot, 1: 2 ilavesi ile FSW kullanılarak <2 × 109 / mL’ye seyreltildi (sperm: kriyodilent)% 30 DMSO. Sütunlar ortalama ± SEM’i gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 1: Mercan biyobankacılık otomatik veri sayfası dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokolde açıklanan yarı otomatik işleme yolu, genetiği tehdit altındaki türlerden korumak ve resif restorasyonu ve adaptasyon çabalarını desteklemek için mercan sperminin verimli bir şekilde işlenmesine ve dondurularak saklanmasına izin verir. Bu protokolün geliştirilmesi için motivasyon, mercan sperm kriyoprezervasyonunun verim gereksinimlerine ve kriyoviyallerin kullanımına uygun mevcut sistemlerin olmamasıydı, çünkü sperm kriyoprezervasyonu için yüksek verimli işleme sistemleri tipik olarak 0,25 mL veya 0,5 mL Fransız pipetlerinde numune paketlemeye dayanmaktadır21,22. Karşılaştırıldığında, kriyoviyaller genellikle ya düşük verimli işleme için küçük ölçekte (örneğin, araştırma için laboratuvar numunelerinin dondurularak saklanması23,24) ya da pahalı, taşınabilir olmayan ekipman (örneğin, endüstri için hücre kültürü işleme) kullanan toplu numuneler için yüksek verimli işleme sistemlerinde kullanılır18,25). Ayrıca, kriyoviyal kapakların çıkarılmasını ve değiştirilmesini kolaylaştırmak için bir otomatik dekapaj sistemi kullanma potansiyelini de araştırdık, ancak sistemler yalnızca bireysel kriyoviyaller veya tüm kriyoviyal raflar için mevcuttu, bu nedenle uygun maliyetli bir çözüm sağlamadılar. Şu anda, mercanların genetik çeşitliliğini güvence altına almak için Hagedorn ve ark.4 tarafından tasarlanan kriyoprezervasyon protokolünü kullanan küresel olarak birkaç grup var ve bu çalışmanın dünya çapında daha fazla resife yayılmaya devam etmesi önemlidir. Bu nedenle, mevcut protokolün geliştirilmesinde önemli bir husus, bu diğer gruplar tarafından kolayca uygulanabilecek ve mercan sperm kriyoprezervasyonuna başlamak isteyen yeni gruplar için maliyet engelleyici olmayacak uygun maliyetli ve erişilebilir teknolojilerin kullanılması ihtiyacıydı.

Açıklanan protokolün önemli bir bileşeni, Microsoft Excel’deki bağlantılı elektronik tablolar aracılığıyla örnek meta verilerin daha iyi işlenmesidir. Veri girişi genellikle basittir, ancak verileri düzenlemek için hızlı işlevler (örneğin, Ctrl + C, Ctrl + V) diğer kullanıcıların eşzamanlı girişlerini potansiyel olarak etkileyeceğinden ve elektronik tablolar arasındaki veri bağlantısında sorunlara neden olabileceğinden, otomatik veri sayfalarındaki bilgilerin düzenlenmesinin yalnızca bilgileri silip yeniden girerek yapılması gerektiğine dikkat edilmelidir. Önemli bir meta veri bileşeni, donör kolonisine bağlı olan ve işleme yolunun tüm aşamalarında numuneye eklenen benzersiz bir tanımlayıcıdır (yani koloni kimliği). Numune tüplerinin, demet toplama sırasında koloni kimliği ile açık bir şekilde etiketlenmesi ve bu bilgilerin, hazırlama sırasında numunenin aktarıldığı herhangi bir yeni tüpe doğru bir şekilde kopyalanması önemlidir (örneğin, yumurtaları ve spermleri ayırmak için filtreleme sırasında veya kriyodilüs ilavesi için). Protokol, numune kalitesi bilgilerinin CASA operatöründen kriyoprezervasyon iş istasyonuna otomatik olarak aktarılmasını sağlasa da, internet veya Wi-Fi kapsama alanı zayıf olduğunda sorunlarla karşılaşılabilir. Veri aktarımında gecikmelerle karşılaşılırsa, iki iş istasyonunun çevrimdışı çalışması ve daha sonra uzlaştırılabilecek ayrı otomatik veri sayfaları tutması önerilir. Kriyoprezervasyon operatörü tarafından istenen temel bilgiler koloni kimliği ve numune konsantrasyonudur, bu nedenle bilgisayarlar arasında meta verilerin yüklenmesinde veya indirilmesinde bir gecikme olması durumunda bu bilgilerin kriyoprezervasyon hazırlığı için hazır olduğundan emin olmak için CASA operatörünün numune konsantrasyonunu, numune tüpüne yedek olarak yazması önerilir.

Bu protokol için kullanılan barkod tarayıcı ve barkodlu kriyovial seçimi, bütçeye ve ürün mevcudiyetine göre değiştirilebilir; Ancak, seçimlerinde dikkate alınması gereken bazı temel unsurlar vardır. Barkod tarayıcı, özelleştirilmiş ayarlar için kapasiteye, özellikle veri giriş özelliklerini ve veri girişinin yönünü değiştirme yeteneğine sahip olmalıdır. Bu protokol için kullanılan otomatik veri sayfaları yatay giriş kullanır, ancak bazı durumlarda (örneğin, biyobankaya erişim veya diğer laboratuvar kullanımları için) dikey giriş gerekebilir, bu nedenle bu özelliğin özelleştirilebilir olması önemlidir. Protokol hem 1D hem de 2D barkodlarla kullanılabilse de, kriyoprezervasyon sırasında numune girişinin çapraz kontrolüne izin vermek için seçilen kriyoviyallerin insan tarafından okunabilir bir bileşene (örneğin, 1D barkodlar tipik olarak benzersiz bir numara içerir) sahip olması önerilir. Numune girişine ek olarak, barkod tarayıcı, yumurtlamadan önce numuneler arasında tekrarlanan bilgiler (örn. tür adları, tarihler ve resif konumları) için QR kodları oluşturup yazdırarak bazı meta veri alanlarının girişini otomatikleştirmek için kullanılabilir. Bu bilgiler daha sonra barkod tarayıcı ile taranarak otomatik veri sayfalarına hızlı ve kolay bir şekilde girilebilir. Ayrıca, her bir kriyo rafına ve termokupl probuna seri numarası barkodları ekleyerek, her bir kriyoprezervasyon çalışmasını veri tabanındaki belirli bir ekipman setine bağlamak da mümkündür, bu da kalite kontrol ve onarım veya değiştirme gerektiren bileşenleri tanımlamak için yararlıdır.

İşlemedeki sınırlayıcı faktörler genellikle demetlerin parçalanmasını beklemek için harcanan süre ve CASA ve kriyoprezervasyondan önce spermi yumurtalardan filtrelemek ve ayırmak için gereken süredir. Mümkün olduğunda, numunelerin demetler parçalanma sırasına göre işlenmesi önerilir; Bununla birlikte, numune işleme siparişlerinin stratejik yönetimi yoluyla verimlilikte daha fazla kazanım elde edilebilir. Örneğin, düşük numune hacimleri (yani, koloni başına 3 mL’den az sperm) veya kriyodilatör ile 2:1 seyreltme gerektiren düşük sperm konsantrasyonu (yani, 2 × 109/mL’den az) nedeniyle koloni başına 5 veya daha az kriyoviyal varsa, o zaman aynı kriyo rafında birlikte çalıştırılabilmeleri için iki koloni örneğine aynı anda kriyodilatör eklemek daha iyidir (toplam # yuvası mevcut = 11), boş alanları dolduran mankenlerle ayrı ayrı çalıştırmak yerine. Ek olarak, tüm işlemlerin >6 dakikalık kriyodiylüent dengeleme süresi içinde tamamlanabilmesini sağlamak için özen gösterilmesi koşuluyla (10 mL hacimli numuneler için) aynı anda birden fazla kriyo rafı çalıştırmak mümkündür, bu da numune verimini daha da artırabilir. Bununla birlikte, birden fazla kriyo rafı çalıştırırken veya birden fazla koloniyi tek bir kriyo rafında birleştirirken, özellikle numuneler CASA değerlendirmesinden farklı bir sırada kriyoprezervasyonla korunuyorsa, kriyoprezervasyon meta verilerinin otomatik veri sayfasındaki doğru numuneye atandığından emin olmak için özen gösterilmelidir.

Yarı otomatik iş akışının geliştirilmesine ek olarak, mevcut protokol açıklaması ayrıca sperm analizi ve kriyoprezervasyon sonuçlarını iyileştirmeyi amaçlayan sperm konsantrasyonu ile ilgili iki metodolojik karşılaştırma sağlar. Genel olarak, 5 mL deniz suyu (toplam hacim 10 mL) üzerinde 5 mL gamet demetlerinin toplanması, 2 × 109 hücre / mL’de veya üzerinde bir sperm konsantrasyonu ile sonuçlanacaktır, ancak tür farklılıkları veya toplama sırasında parçalanan demetler nedeniyle sperm konsantrasyonunun daha düşük olabileceği durumlar vardır. Daha yüksek konsantrasyonlu bir DMSO kriyodilüsleyicinin (%30 v/v) kullanılması, kriyoviyaldeki sperm konsantrasyonundaki partiden partiye değişimi en aza indirmeye yardımcı olmak için spermin seyreltilme miktarını azaltır. Daha da önemlisi, nihai DMSO konsantrasyonunu elde etmek için% 30 DMSO’nun kullanılması, Şekil 3’teki temsili verilerle gösterildiği gibi, çözülme sonrası konsantrasyonu veya motilite parametrelerini etkilemez. İkinci metodolojik karşılaştırma, tipik olarak CASA için kullanılan tek kullanımlık sabit lamel hazneli kızaklara bir alternatif sağlar. Mercan sperminin analizi için ticari olarak temin edilebilen slaytların kullanılmasındaki temel zorluk, spermin slayt kaplamasına yapışması nedeniyle motilite değerlendirmesinin doğruluğunu etkileyebilmeleridir. Aktivasyon çözeltisinin kullanılması, tüm numunelerde olmasa da birçok örnekte bu sorunun üstesinden gelir, bu nedenle güvenilirlik ve tutarlılığı sağlamak için düz bir slayt kullanarak motilite için ayrı bir CASA analizi yapılması önerilir. Bir Makler sayma odasının kullanılması, konsantrasyon ve motiliteyi ayrı ayrı analiz etme ihtiyacının üstesinden gelir ve potansiyel olarak konsantrasyon ölçümlerinin doğruluğunu artırır (Şekil 2), bu nedenle mevcut protokolle kullanılması önerilir. Daha önce20 kez bildirilen bir bulgu olan konsantrasyon ölçümlerindeki bu tutarsızlık göz önüne alındığında, sperm kalitesi verilerinin yanı sıra veri tabanındaki slayt ayrıntılarını her zaman kaydetmek ve mümkün olan her yerde, partiden partiye varyasyonu en aza indirmek ve spermin güvenilir bir şekilde hesaplanmasını sağlamaya yardımcı olmak için kullanılan oda slaytı tipinde tutarlı olmak önemlidir: döllenmeler için yumurta oranları.

Burada açıklanan yarı otomatik süreç, numune biyogüvenliğini ve kalitesini korurken, tehdit altındaki mercan türlerinden spermlerin dondurularak saklanması ve biyobankacılığı için standartlaştırılmış ve verimli bir yol sağlar. Açıklanan protokol, neslinin tükenmesini önlemek ve şimdi ve gelecekte resif restorasyon çabaları için mevcut kaynakları en üst düzeye çıkarmak için gerekli olacak kriyoprezervasyon kullanarak mevcut mercan çeşitliliğini güvence altına almak için çalışan dünya çapındaki programlarda kolayca aktarılabilir ve nispeten ucuzdur.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Konomie’nin Geleneksel Sahiplerine, Woppaburra halkına, Kasım 2022’de ülke içi yumurtlama sırasında bu belgede açıklanan sistemi deneme izni için ve tesislerinin kullanımı için Konomie Çevre Eğitim Merkezi’ne teşekkür ederiz. Ayrıca, Ulusal Deniz Simülatörü içinde kolonilerin toplanmasını ve yumurtlanmasını kolaylaştıran Avustralya Deniz Bilimleri Enstitüsü personelinin ve bilim adamlarının desteğini de kabul etmek isteriz. Bu çalışma, Avustralya Hükümeti’nin Reef Trust ve Great Barrier Reef Vakfı arasındaki bir ortaklık olan Resif Restorasyonu ve Adaptasyon Programı için Kriyoprezervasyon alt programının (RRAP-CP-01) bir faaliyeti olarak, Taronga Koruma Derneği Avustralya, Taronga Koruma Bilimi Girişimi ve Taronga Vakfı’nı destekleyen diğer hayırseverlerin ek desteğiyle gerçekleştirilmiştir.

Materials

Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller – Aliquotting pipette Vistalab 2100-1005 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
5 mL serological pipettes (bulk) Thermo Scientific  Nunc 170355 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
10 mL serological pipettes (bulk) Thermo Scientific Nunc  170356 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
P2 0.2–2 µL pipettor Gilson F144054M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P10 1–10 µL pipettor Gilson F144055M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P20 2–20 µL pipettor Gilson  F144056M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P200 20–200 µL pipettor Gilson F144058M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P1000 100–1000 µL pipettor Gilson F144059M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
Vacuum pump Millipore WP6122050 Preparation of filtered sea water for solution preparation
Reusable bottle-top filtration system Thermo Scientific DS0320-5045 Preparation of filtered sea water for solution preparation
0.22-µm filter discs, mixed cellulose esters  Merck Millipore GSWP04700 Preparation of filtered sea water for solution preparation
Filtered sea water N/A – Base medium for sperm activation and cryoprotectant solutions
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 Cryoprotectant chemical used at a final concentration of 10% v/v in filtered seawater for sperm cryopreservation
Caffeine Sigma-Aldrich C0750 Used to activate sperm motility
BSA heat shock fraction Sigma-Aldrich A9647 Used to minimise sperm adherance to CASA well slides
15-mL tubes – racked Thermo Scientific 339651 Preparation of sperm activation solution
50-mL tubes racked Thermo Scientific 339653 For collection of gamete bundles and filtered sperm samples
Transfer pipettes Thermo Scientific Samco 202PK To aid collection of gamete bundles from the water surface
100-µm filter baskets Fisher Scientific 22363549 To exclude eggs during separation of the sperm sample
Eppendorf racks Interpath 511029 Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Eppendorf 1.5-mL tube Eppendorf 30120086 Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Glass coverslips 18×18 mm Brand 4700 45 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Plain glass slides, precleaned, 75×25 mm Corning 2947 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Haemocytometer Hausser Scientific 1492 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
CASA slides (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B) IMV Technologies 025107 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Makler sperm counting chamber (CASA) IVFStore SM-373 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
accu-bead® counting beads Hamilton-Thorne 710111 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
CASA system + laptop Hamilton Thorne Ceros II Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Safety Glasses Generic – Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Lab coat Long sleeve, full length – Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Cryogloves (pair) Tempshield Mid-Arm Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Medium forceps Generic – For removing cryopreserved samples from the cryo racks and manipulating samples in liquid nitrogen
Barcode scanner (2D compatible) Zebra DS2278 For reading 1D and 2D barcodes on cryovials for sample management
2.0-mL CryoStorage Vial, external thread, pre-capped, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), linear and human readable Eppendorf 30079434 Barcoded cryovials for cryopreservation of sperm samples
Cryovial rack Simport T315 Rack to hold cryovials, with locking base to allow for one hand de-capping and capping
Freezing racks Custom – Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing rack lid Custom – Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container Isosteel  VA-9683  Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Lab timers Generic – For timing of cryoprotectant equilibration prior to cryopreservation
Nitrogen bath 9L BelArt M16807-9104 For quenching samples during cryopreservaton and holding samples during sorting and handling
Thermocouple data logger- multichannel Omega HH520 Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Thermocouple probe – Type K Omega 5SC-TT-K-30-36 Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Cryo pens/coloured permanent pen Staedtler Lumocolor 318 Optional for marking cryovial lids to assist with sample management
Dry Shipper – charged Taylor Wharton CXR100, or CX500 For transfer of cryopreserved samples from field/collection sites to the biorepository for storage
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eakin, C. M., Sweatman, H. P. A., Brainard, R. E. The 2014-2017 global-scale coral bleaching event: Insights and impacts. Coral Reefs. 38 (4), 539-545 (2019).
  2. Anthony, K., et al. New interventions are needed to save coral reefs. Nature Ecology & Evolution. 1 (10), 1-3 (2017).
  3. Wildt, D. E. Genome resource banking for wildlife research, management, and conservation. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 41 (4), 228-234 (2000).
  4. Hagedorn, M., et al. Preserving and using germplasm and dissociated embryonic cells for conserving Caribbean and Pacific coral. PLoS ONE. 7 (3), e33354 (2012).
  5. Hagedorn, M., et al. First frozen repository for the Great Barrier Reef coral created. Cryobiology. 65 (2), 157-158 (2012).
  6. Zuchowicz, N., Daly, J., Lager, C., Williamson, O., Hagedorn, M. Freezing on the beach: A robust coral sperm cryopreservation design. Cryobiology. 101, 135-139 (2021).
  7. Hobbs, R. J., et al. A decade of coral biobanking science in Australia – transitioning into applied reef restoration. Frontiers in Marine Science. , 9 (2022).
  8. Daly, J., et al. Cryopreservation can assist gene flow on the Great Barrier Reef. Coral Reefs. 41, 455-462 (2022).
  9. Hagedorn, M., et al. Assisted gene flow using cryopreserved sperm in critically endangered coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (38), e2110559118 (2021).
  10. Daly, J., et al. Successful cryopreservation of coral larvae using vitrification and laser warming. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
  11. Daly, J., et al. The first proof of concept demonstration of nanowarming in coral tissue. Advanced Sustainable Systems. , (2023).
  12. Powell-Palm, M. J., et al. Cryopreservation and revival of Hawaiian stony corals via isochoric vitrification. Nature Communications. 14, 4859 (2023).
  13. . Reef Restoration and Adaptation Program Available from: https://gbrrestoration.org (2023)
  14. . Florida Coral Rescue Available from: https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue (2023)
  15. Harrison, P. L. . Coral reefs: An ecosystem in transition. , 59-85 (2011).
  16. Hagedorn, M., Carter, V. L. Cryobiology: Principles, species conservation and benefits for coral reefs. Reproduction, Fertility and Development. 28 (8), 1049 (2016).
  17. Zuchowicz, N., et al. Assessing coral sperm motility. Scientific Reports. 11, 61 (2021).
  18. Thomas, D. Evaluation of an automated cryovial dispensing system for cell banking. Genetic Engineering & Biotechnology News. 37 (17), 22-23 (2017).
  19. . Coral cryopreservation training course Available from: https://nationalzoo.si.edu/center-for-species-survival/coral-cryopreservation-training-course (2023)
  20. Bailey, E., et al. Validation of sperm counting methods using limits of agreement. Journal of Andrology. 28 (3), 364-373 (2007).
  21. Hu, E., Yang, H., Tiersch, T. R. High-throughput cryopreservation of spermatozoa of blue catfish (Ictalurus furcatus): Establishment of an approach for commercial-scale processing. Cryobiology. 62 (1), 74-82 (2011).
  22. Pickett, B. W., Berndtson, W. E. Preservation of bovine spermatozoa by freezing in straws: A review. Journal of Dairy Science. 57 (11), 1287-1308 (1974).
  23. Westbrook, C. E., Daly, J., Bowen, B., Hagedorn, M. Cryopreservation of the collector urchin embryo, Tripneustes gratilla. Cryobiology. 15, 104865 (2024).
  24. Maria, A. N., et al. Use of cryotubes for the cryopreservation of Tambaqui fish semen (Colossoma macropomum). Cryobiology. 70 (2), 109-114 (2015).
  25. Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreservation & Biobanking. 21 (1), 106-110 (2023).

Tags

Coral CryopreservationSperm CryopreservationBiobankingCoral Reef RestorationSemi-automated WorkflowComputer-assisted Sperm AnalysisMetadata ManagementGenetic DiversityAquacultureReef Adaptation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Daly, J., Hobbs, R., Zuchowicz, N., Hagedorn, M., O’Brien, J. K. A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture. J. Vis. Exp. (208), e66233, doi:10.3791/66233 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image