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Um fluxo de trabalho semiautomatizado para a criopreservação de espermatozóides de coral para apoiar biobancos e aquicultura

Published: June 07, 2024
doi:
10.3791/66233
, , , ,
1Taronga Institute of Science and Learning,Taronga Conservation Society Australia, 2School of Biological, Earth and Environmental Sciences,University of New South Wales, 3Department of Mechanical Engineering,University of Minnesota, 4Hawaii Institute of Marine Biology,University of Hawaii, 5Smithsonian National Zoo and Conservation Biology Institute

Summary

Este protocolo descreve um caminho semiautomatizado para melhorar a eficiência e a capacidade de processamento e criopreservação de espermatozoides de espécies de corais ameaçadas, com o objetivo de garantir a diversidade genética e apoiar os esforços de restauração de recifes.

Abstract

Os recifes de coral estão enfrentando uma crise à medida que aumenta a frequência de eventos de branqueamento causados pelo aquecimento do oceano, resultando na morte de corais em recifes em todo o mundo. A subsequente perda de diversidade genética e biodiversidade pode diminuir a capacidade dos corais de se adaptar às mudanças climáticas, portanto, os esforços para preservar a diversidade existente são essenciais para maximizar os recursos disponíveis para a restauração dos recifes agora e no futuro. A abordagem mais eficaz para garantir a genética a longo prazo é a criopreservação e o biobanco, que permite o armazenamento congelado de amostras vivas em temperaturas criogênicas em nitrogênio líquido indefinidamente. A criopreservação de espermatozóides de coral é possível desde 2012, mas a natureza sazonal da reprodução de corais significa que as atividades de biobancos são restritas a apenas algumas noites por ano, quando ocorre a desova. Melhorar a eficiência dos fluxos de trabalho de processamento e criopreservação de espermatozóides de coral é, portanto, essencial para maximizar essas oportunidades limitadas de biobanco. Para esse fim, nos propusemos a otimizar as vias de processamento de criopreservação para espermatozoides de coral, com base nas tecnologias existentes e criando uma abordagem semiautomatizada para agilizar a avaliação, manuseio e criopreservação de espermatozoides de coral. O processo, que combina análise de esperma assistida por computador, criogeniais com código de barras e uma série de folhas de dados automáticas vinculadas para edição simultânea por vários usuários, melhora a eficiência do processamento de amostras e do gerenciamento de metadados em campo. Por meio da integração com programas de pesquisa transversais, como o Programa de Restauração e Adaptação de Recifes na Austrália, a criopreservação pode desempenhar um papel crucial em programas de restauração de recifes em larga escala, facilitando o manejo genético de populações de aquicultura, apoiando pesquisas para aumentar a tolerância térmica e prevenir a extinção de espécies de corais. Os procedimentos descritos serão utilizados para profissionais de criopreservação de corais e biobancos em recifes em todo o mundo e fornecerão um modelo para a transição de tecnologias de criopreservação de laboratórios de pesquisa para aplicações em larga escala.

Introduction

Os recifes de coral em todo o mundo estão experimentando uma perda de espécies de corais, populações e diversidade genética devido ao aquecimento e acidificação dos oceanos causados pelas mudanças climáticas, diminuindo a viabilidade desses habitats críticos e impactando as espécies que eles sustentam 1,2. A abordagem mais eficaz para garantir a genética a longo prazo é a criopreservação e o biobanco, que permite o armazenamento congelado de amostras vivas em temperaturas criogênicas em nitrogênio líquidoindefinidamente 3. O desenvolvimento, em 2012, de métodos para a criopreservação de espermatozoides de corais4 possibilitou pela primeira vez o biobanco de genética dessas espécies e levou ao desenvolvimento do primeiro biorrepositório de genética de corais em 20125. Desde então, esse protocolo de criopreservação foi refinado6 e usado para garantir a genética de mais de 50 espécies de corais em todo o mundo, com 30 dessas espécies provenientes da Grande Barreira de Corais na Austrália7. O esperma de coral criopreservado pode gerar corais saudáveis que se desenvolvem normalmente e têm sido usados para facilitar experimentos de fluxo gênico assistido na Austrália8 e no Caribe9. Embora as tecnologias estejam atualmente em desenvolvimento para permitir a criopreservação de tipos complexos de tecidos, como larvas10 e tecidos de corais adultos11,12, a criopreservação de espermatozóides de coral é atualmente a ferramenta mais estabelecida disponível para o biobanco de rotina da genética de corais.

À medida que os impactos nas populações de corais aumentaram, vários países iniciaram programas de grande escala para apoiar a restauração e adaptação de recifes (por exemplo, o Programa de Restauração e Adaptação de Recifes [RRAP] na Austrália13) ou para garantir as populações de corais ameaçadas remanescentes (por exemplo, Florida Coral Rescue nos EUA14). No contexto desses programas, a criopreservação pode ser pensada como uma tecnologia facilitadora, apoiando a pesquisa e a produção de corais em larga escala, além de garantir a diversidade genética existente e prevenir extinções. A criopreservação de espermatozoides pode permitir um maior controle sobre a reprodução entre populações que estão física ou temporalmente separadas e pode permitir o manejo genético de reprodutores para selecionar características desejáveis, como tolerância térmica ou resistência a doenças8. Até o momento, o biobanco de espermatozóides de coral foi realizado em uma escala relativamente pequena em apoio ao manejo da biodiversidade7, portanto, algum nível de aumento será necessário para que esse biobanco atinja seu potencial dentro desses programas maiores de restauração de recifes. Tal como acontece com todos os esforços de restauração de recifes baseados na reprodução de corais, o principal impedimento para aumentar os esforços de biobanco é o período limitado durante o qual os gametas de coral estão disponíveis, uma vez que a desova na maioria das espécies de construção de recifes coincide com a lua cheia no final da primavera e início do verão15, o que significa que os gametas estão disponíveis apenas para criopreservação e biobanco em algumas noites a cada ano. Além disso, em regiões onde ocorre desova em massa, por exemplo, a Grande Barreira de Corais, normalmente há várias espécies desovando simultaneamente ou com poucas horas de diferença uma da outra na mesma noite15. Melhorias na via de criopreservação de espermatozóides são, portanto, necessárias para aumentar a escala e a eficiência do processamento para maximizar a capacidade do biobanco durante essas breves janelas anuais de desova, garantindo a integridade das amostras e metadados associados.

A criopreservação e o biobanco de espermatozoides de corais envolvem várias etapas principais, desde a coleta de gametas durante a desova até a adesão das amostras ao biorrepositório e banco de dados (Figura 1). O processo inicia-se com a separação dos espermatozoides dos óvulos (nas espécies hermafroditas) ou a recolha dos espermatozoides da coluna de água (nas espécies gonocóricas), seguindo-se a avaliação da motilidade e concentração dos espermatozoides. Os espermatozoides são então combinados com crioprotetor (concentração final de 10% v / v, dimetilsulfóxido, DMSO) em água do mar filtrada (FSW) e resfriados a -20 ° C / min em um dispositivo de resfriamento projetado sob medida4. As primeiras iterações desse processo dependiam da avaliação visual da motilidade e concentração dos espermatozoides por meio de microscopia de contraste de fase e contagem de hemocitômetros, impressão e rotulagem de tubos à medida que as amostras eram processadas para criopreservação, pipetagem manual de amostras de esperma em criogeniais e resfriamento em um rack flutuante especialmente projetado16. A aplicação da análise de esperma assistida por computador (CASA)17 e o desenvolvimento de um dispositivo de resfriamento impresso em3D6 melhoraram a eficiência e a confiabilidade da criopreservação de espermatozóides de coral, mas a via de processamento de amostras de esperma permaneceu praticamente a mesma desde o seu início. Embora essa abordagem seja adequada para processar amostras de um número moderado de colônias e espécies em uma noite de desova, para grandes volumes e números de colônias (por exemplo, amostras individuais de >10 colônias por vez), existem gargalos na via de criopreservação que impedem o processamento das amostras em tempo hábil (ou seja, dentro de 2 h após a liberação do esperma) sem degradação do potencial de fertilidade da amostra. Embora sistemas de manuseio de fluidos em larga escala para criogeniais estejam disponíveis (por exemplo, Thomas et al.18), eles são normalmente projetados para processamento de grandes lotes (ou seja, vários racks de criogeniais) e não são adequados para transporte e uso em campo, portanto, não são econômicos para esta aplicação. Portanto, o presente estudo teve como objetivo melhorar a eficiência da criopreservação de espermatozóides de coral, introduzindo equipamentos e métodos de automação portáteis e baratos em etapas-chave da via de processamento para maximizar o número de amostras que poderiam ser efetivamente criopreservadas em uma noite de desova.

Protocol

Os métodos aqui descritos podem ser usados para processar e criopreservar espermatozoides de espécies de corais hermafroditas e gonocóricos. Uma introdução geral e uma cartilha sobre desova de corais e coleta de gametas para criopreservação de espermatozóides para ambos os modos reprodutivos podem ser encontradas no Curso de Treinamento em Criopreservação de Corais do Smithsonian’s National Zoo & Conservation Biology Institute19. Os métodos descritos foram desenvolvidos principalmente usando gametas de colônias de Acropora millepora coletadas do grupo da Ilha Keppel no País do Mar de Woppaburra e do Recife Davies no País do Mar de Bindal, na Grande Barreira de Corais na Austrália. Toda a coleta e uso de corais e gametas foram realizados com o consentimento livre, prévio e informado dos Guardiões Tradicionais dos Países do Mar relevantes. Os reagentes e equipamentos utilizados para este estudo estão listados na Tabela de Materiais. 1. Pré-desova – verificações do sistema e preparação da solução de ativação do esperma e do criodiluente Confirme se o leitor de código de barras está carregado, ativo e configurado para inserir dados da planilha como entrada de célula horizontal. Consulte o manual do usuário do leitor de código de barras para personalizar essa configuração. Prepare soluções de estoque concentradas de ativação de espermatozóides de coral para CASA.NOTA: Luvas descartáveis devem ser usadas ao manusear produtos químicos para preparação da solução de ativação.Prepare a solução-mãe de albumina de soro bovino (BSA) a 30% (5 mL) dissolvendo 1,5 g de BSA em 4 mL de água de cultura de tecidos purificada estéril com o auxílio de um aquecedor de tubos ajustado para 37 ° C ou segurando o tubo com as mãos em concha, com giros suaves periódicos (não agite o frasco). Uma vez em solução, completar o volume final (5 ml) com água de cultura de tecidos, indicar a data no tubo e marcar “30% BSA em H2O”. Conservar no frigorífico (4 °C) até 2 semanas. Prepare 60 mM de solução estoque de cafeína (25 mL) dissolvendo 0,2913 g de cafeína em 24 mL de água do mar filtrada (FSW). Uma vez em solução, completar o volume final (25 ml) com FSW, rotular o tubo com a data e marcar “60 mM de cafeína em FSW”. Guarde na geladeira por até 1 mês.NOTA: A solubilidade máxima da cafeína em FSW é de aproximadamente 71 mM. Prepare a solução de trabalho de ativação de espermatozóides para amostras de esperma a ~ 109 espermatozóides / mL (0,9% BSA + 12 mM de cafeína em FSW).Para uma solução de trabalho de 10 mL, combine 2,0 mL de solução estoque de cafeína 60 mM + 0,3 mL de solução estoque BSA a 30% + 7,7 mL de FSW. Rotule o tubo com data e “solução de trabalho de ativação de espermatozóides – 0,9% BSA + 12 mM de cafeína”. Prepare em cada dia de uso, armazene em temperatura ambiente (19-30 ° C) e descarte a solução não utilizada no final do dia. Prepare soluções crioprotetoras (criodiluentes). Certifique-se de que luvas descartáveis sejam usadas ao manusear o crioprotetor DMSO.NOTA: O SSF é preparado com concentrações variadas de crioprotetor, dependendo da concentração inicial de espermatozóides em uma amostra e da concentração final desejada de alíquotas criopreservadas. Ao preparar o criodiluente, certifique-se de que o FSW seja aliquotado no tubo de 50 mL antes da adição de DMSO.Colete água do mar bruta do sistema de tanques em que os corais são mantidos antes da desova (salinidade de ~ 35 ppt). Filtrar a água do mar bruta utilizando um sistema de filtragem de topo de garrafa ligado a uma bomba de vácuo com um filtro de membrana não pirogénica de 0,2 μm instalado. Para uma concentração de espermatozóides ≥2 × 109 espermatozóides / mL, prepare 20% de DMSO em FSW combinando 10 mL de DMSO + 40 mL de FSW em um tubo de 50 mL. Para uma concentração de espermatozóides <2 × 109 espermatozóides / mL, prepare 30% de DMSO em FSW combinando 15 mL de DMSO + 35 mL de FSW em um tubo de 50 mL. Rotule o tubo com a data e a concentração de DMSO, ou seja, 30% de DMSO ou 20% de DMSO. Preparar em cada dia de utilização, conservar à temperatura ambiente (19-30 °C) e eliminar a solução não utilizada no final de cada dia.NOTA: A mistura de DMSO e FSW cria uma reação exotérmica, e o criodiluente deve ser preparado bem antes do uso para permitir o resfriamento à temperatura ambiente. A FSW pode ser armazenada a 4 °C para preparação do criodiluente para contrabalançar essa geração de calor. Prepare o registrador de dados do termopar.Para medir a taxa de resfriamento aproximada de cada execução de criopreservação, coloque um criovial contendo 10% de DMSO em FSW com uma sonda de termopar inserida através da tampa em um slot de amostra do rack de criopreservação ao lado das amostras de esperma. Para fazer um frasco de termopar, faça ou derreta um pequeno orifício na tampa do criopar com código de barras e insira um termopar tipo K ou tipo T pela abertura. Empurre a ponta da sonda do termopar para baixo a um nível tal que ela fique no meio da amostra quando o frasco estiver cheio, mantendo a ponta da sonda centralizada no frasco para evitar o contato com a parede interna do frasco. Feche a tampa e segure a sonda do termopar no lugar com cola quente. Usando luvas descartáveis, preencha o criovial com código de barras com um volume de 10% de DMSO em FSW igual ao volume da amostra de esperma a ser criopreservada. Prepare DMSO fresco a 10% em FSW e reabasteça os frascos de termopar diariamente. 2. Preparação e avaliação do esperma Para espécies hermafroditas (por exemplo, espécies de Acropora ), colete feixes de gametas da superfície da água usando uma pipeta de transferência de 3 mL e coloque-os em um tubo rotulado de 50 mL na proporção de 5 mL de feixes de gametas sobre 5 mL de água do mar (volume total de 10 mL). Para espécies gonocóricas, colete espermatozóides próximos à boca do pólipo usando uma pipeta de transferência de 3 mL e coloque a amostra em um tubo de 50 mL rotulado e, em seguida, prossiga diretamente para a etapa 2.8.NOTA: Luvas descartáveis não são necessárias para a coleta e manuseio de amostras de gametas, mas podem ser usadas se preferir. As mãos devem ser bem lavadas com água doce ou as luvas trocadas entre cada amostra de gameta para evitar contaminação cruzada. Para espécies hermafroditas, agite os feixes de espermatozóides-óvulos girando suavemente a amostra com a mão até que os feixes se quebrem.NOTA: Algumas espécies de Montipora têm uma toxina nos óvulos, portanto, eles devem se desfazer lentamente com o mínimo de agitação para evitar danos aos espermatozoides. Deixe a amostra descansar por 2 minutos em um suporte de tubo para permitir que os óvulos flutuem para a superfície e os espermatozoides se depositem (os óvulos formarão uma camada rosa / marrom na superfície e os óvulos individuais serão visíveis; veja a Figura 1i). Para separar o esperma e remover os óvulos contaminantes, aspire suavemente o esperma do fundo do tubo usando uma pipeta de transferência limpa de 3 mL. Transfira a amostra de esperma para um filtro de células de 100 μm em cima de um novo tubo de centrífuga estéril de 50 mL. A amostra deve fluir facilmente através do filtro. Bata no filtro para estimular o fluxo de amostra e, se necessário, uma pipeta de transferência limpa pode ser usada para coletar qualquer amostra residual da parte inferior do filtro. Remova o filtro e tampe o tubo frouxamente para permitir a troca de ar. Rotule a amostra de esperma filtrada com o ID da colônia e mova a amostra para a estação de trabalho de avaliação de esperma. Abra o arquivo de folha de dados automática do biobanco de coral (Arquivo Suplementar 1). Na guia de avaliação de esperma, insira os metadados da colônia de coral (colunas AH). Prepare o esperma para avaliação CASA.Misture bem a amostra de esperma e remova uma alíquota de 10 μL para um tubo de microcentrífuga vazio de 1,8 mL. Adicione imediatamente 0,390 mL de solução de trabalho de ativação de espermatozóides gota a gota por 10-20 s, misturando suavemente os espermatozoides na solução. Isso dá uma proporção de diluição de 1:39 (espermatozóide: solução, v / v) (ou fator de diluição de 40), que fornece uma concentração apropriada para avaliação CASA (~ 50 × 106 / mL) se a concentração de espermatozóides brutos for ~ 2 × 109 espermatozóides / mL. Inverta o tubo 5 vezes e sacuda a tampa do tubo antes de abrir para assentar a solução no fundo do tubo.NOTA: A concentração de espermatozoides para CASA deve estar na faixa de 8-50 × 106/mL para permitir o rastreamento preciso de espermatozoides17. Solução de trabalho de ativação de espermatozóides adicional pode ser adicionada à alíquota de esperma cru para reduzir a concentração, se necessário. Recalcule a taxa de diluição e insira esse valor na planilha. Nos casos em que muitas amostras devem ser processadas simultaneamente, os tubos de microcentrífuga de 1,8 mL podem ser pré-carregados com 0,390 mL de solução de trabalho de ativação de esperma com a alíquota de 10 μL de amostra de esperma adicionada diretamente a ela e, em seguida, bem misturados invertendo o tubo 10× e sacudindo a tampa do tubo antes de abrir. Avalie a motilidade espermática e a concentração da amostra ativada usando análise de esperma assistida por computador (CASA), conforme descrito em Zuchowicz et al.17 , colocando 4 μL de suspensão de espermatozoides ativados em uma câmara de contagem de Makler20 ou por avaliação visual e contagem de hemocitômetros sob microscopia de contraste de fase, conforme descrito em Hagedorn et al.4.NOTA: A câmara Makler e a lamínula devem ser bem limpas com etanol a 70%, depois água destilada e limpas com um lenço de papel sem fiapos entre as amostras. Insira o fator de diluição do esperma usado para avaliação do CASA e insira as saídas do CASA para concentração de espermatozóides (milhão/mL), motilidade total (%) e motilidade progressiva (%) na folha de dados automática.NOTA: Métricas CASA adicionais, incluindo velocidade média do caminho (VAP), velocidade em linha reta (VSL) e velocidade curvilínea (VCL) podem ser incluídas opcionalmente na folha de dados automática ou recuperadas de arquivos CASA salvos posteriormente. Escreva a concentração de esperma no tubo de amostra de esperma filtrado e transfira a amostra para a estação de trabalho de criopreservação na mesma ordem de quebra e processamento do feixe. 3. Diluição do esperma e equilíbrio crioprotetor Na estação de trabalho de criopreservação, abra o mesmo arquivo de folha de dados automática de biobanco de coral que a estação de trabalho de avaliação de esperma está usando e selecione a guia Criopreservação . Verifique o rótulo do tubo de amostra de esperma e identifique a entrada correspondente verificando o ID da colônia (coluna C). Se não estiver acessando o mesmo arquivo de folha de dados automática simultaneamente entre as estações de trabalho, insira manualmente os dados no ID da colônia (coluna C) e na concentração de espermatozóides (coluna F) na folha de dados automática. Usando uma pipeta sorológica, meça o volume da amostra de esperma puxando a amostra para a pipeta e expelindo-a de volta para o mesmo tubo; insira o valor na coluna E. Verifique a coluna I calculada automaticamente para a concentração de crioprotetor necessária e a coluna H para o volume de criodiluente a ser adicionado (Tabela 1). Inicie um temporizador por 10 min e, usando uma pipeta sorológica, comece imediatamente a adicionar o criodiluente, gota a gota, com mistura suave constante da amostra, garantindo que luvas descartáveis sejam usadas para o manuseio do DMSO. Registar o tempo de adição do criodiluente na coluna P. Concentração de espermatozóides Criodiluente Razão de diluição (esperma:criodiluente) Concentração final de DMSO na amostra de esperma (%) < 2 × 109/mL 30% DMSO em MPS 2:1 10% ≥ 2 × 109/mL 20% DMSO em MPS 1:1 10% Tabela 1: Concentração de criodiluente e taxas de diluição para criopreservação de espermatozóides de coral, com base na avaliação da concentração total de espermatozóides na amostra a ser criopreservada. 4. Criopreservação de espermatozoides Leia a coluna K para determinar quantos criogeniais preencher. Isso é calculado automaticamente a partir do volume total de espermatozóides e do volume desejado por frasco (1 mL na maioria dos casos). Durante o período de incubação de 10 minutos, prossiga com as etapas 4.2 a 4.6. Destampe os criotubos estéreis com código de barras e coloque as tampas em uma superfície limpa/estéril. Opcional: Escreva o run # em cada criogenia usando um marcador permanente; Isso pode ajudar na identificação rápida da amostra para acesso ao biobanco. Usando uma pipeta sorológica e uma pipeta de alíquota ajustada para o volume de amostra desejado (1 mL), alíquota de amostras em criogeniais com código de barras sem tampa e frascos de recape. Coloque um frasco de termopar e todos os frascos de amostra cheios em um rack criogênico vazio em temperatura ambiente. Certifique-se de que a superfície com código de barras esteja voltada para fora em todos os frascos. Se necessário, coloque criogeniais fictícios adicionais contendo 10% de DMSO em FSW em quaisquer espaços vazios no rack criogênico para garantir que todos os espaços estejam ocupados. Insira o número da execução na folha de dados automática (coluna U) e digitalize o número de série do rack criogênico (código QR) na coluna V. Coloque o cursor na célula correta da coluna Z e escaneie no frasco do termopar, seguido por todos os tubos crioviais que estão carregados no rack (coluna AA em diante). Evite inclinar o rack de lado para garantir que a amostra não entre na rosca do frasco. Durante a digitalização, verifique se os dados estão sendo inseridos na célula correta e se todos os criogeniais foram verificados uma vez. Separe os racks carregados e escaneados pelo restante do período de equilíbrio do crioprotetor e prepare o recipiente de resfriamento para criopreservação. Encha o recipiente de resfriamento do rack criogênico com nitrogênio líquido até o nível pré-determinado apropriado necessário para resfriamento a aproximadamente -20 ° C / min.NOTA: O nitrogênio só deve ser usado em áreas bem ventiladas, pois existe risco de asfixia. Sapatos fechados, óculos de segurança/protetores faciais e luvas criogênicas devem ser usados ao manusear nitrogênio líquido. Consulte as diretrizes institucionais para obter informações específicas sobre manuseio e uso de nitrogênio líquido. No final do período de equilíbrio crioprotetor de 10 minutos, conecte a sonda do termopar ao registrador de dados e comece a gravar, em seguida, coloque suavemente o rack criogênico cheio no recipiente de resfriamento e aplique a tampa. Registre a hora de início na coluna Q. Assim que o frasco do termopar ler -80 ° C ou menos no registrador de dados, resfrie as amostras em nitrogênio líquido transferindo a inserção do rack criogênico para um banho de nitrogênio líquido em um recipiente separado, como uma caixa de poliestireno. Remova os criogeniais do rack e transfira-os para um transportador seco para transporte para o biorrepositório.

Representative Results

As etapas descritas neste protocolo baseiam-se nos métodos originais de criopreservação de espermatozóides de coral descritos por Hagedorn et al.4 e refinamento subsequente por Zuchowicz et al.6, fornecendo melhorias importantes para aumentar a eficiência do processamento de espermatozóides para criopreservação e biobanco. O uso de criogeniais com código de barras e um pipetador automático de alíquota simplifica o procedimento de empacotamento de esperma, eliminando a necessidade de imprimir e rotular manualmente os criogeniais, e reduz a tensão de pipetar manualmente um grande número de amostras. É importante ressaltar que essas melhorias também reduzem o tempo necessário para a preparação da amostra para criopreservação, de cerca de 8 a 10 minutos para menos de 5 minutos. Juntamente com o uso do CASA, essas melhorias reduzem o número de pessoal necessário para um biobanco eficiente de esperma de coral, de 4 para 6 nos métodos originais, para apenas duas pessoas usando o protocolo atual. Além disso, o uso de criogeniais com código de barras significa que cada tubo tem um identificador exclusivo, para que cada um possa ser rastreado no banco de dados com maior resolução do que o método anterior usando etiquetas impressas em lote. O teste de campo do protocolo em dois eventos de desova durante a temporada de desova da Grande Barreira de Corais de 2022 na Austrália resultou na criopreservação e biobanco de 389 amostras de 57 colônias em 5 espécies por dois operadores (uma pessoa para CASA, uma pessoa para criopreservação), com uma pessoa adicional auxiliando na quebra do feixe e separação de espermatozóides conforme necessário. Durante o evento de desova de novembro de 2022 em Konomie (Ilha Keppel do Norte) em Queensland, Austrália, 150 amostras de 24 colônias de Acropora millepora foram criopreservadas por dois operadores durante um período de 2 horas. O processamento e criopreservação eficientes desse volume de amostras de um número tão grande de colônias de corais foram possibilitados principalmente pelas eficiências obtidas no tempo de preparação das amostras e pela transferência simplificada de metadados entre as estações de trabalho. Testes adicionais do fluxo de trabalho durante a desova em dezembro de 2023 determinaram que, para espermatozóides de coral, a câmara de contagem Makler forneceu dados de motilidade e concentração mais precisos em comparação com as lâminas de câmara de uso único de lamínula fixas disponíveis comercialmente comumente usadas com sistemas CASA. A câmara de contagem de Makler foi validada para CASA usando microesferas de látex disponíveis comercialmente em uma concentração conhecida com um volume de amostra de 4 μL e as configurações padrão CASA17 usadas para espermatozóides de coral. Essas análises mostraram contagens consistentes com baixa variabilidade (44,5 ± 0,7 milhão/mL) que se enquadraram na faixa de concentração esperada (46,0 ± 7,0 milhões/mL) fornecida pelo fabricante (Figura 2). Uma comparação dos dados do CASA para Acropora millepora coletados usando a câmara de contagem de Makler e as lâminas da câmara de lamínula fixa encontrou uma diferença significativa na contagem de espermatozoides entre os dois tipos de câmara (P = 0,002; Figura 2), com as lâminas da câmara de lamínula fixa registrando menos da metade da concentração determinada pela câmara de contagem de Makler. Essa tendência também foi observada em amostras de esperma de duas outras espécies de corais (dados não mostrados). Os testes durante dezembro de 2023 também não encontraram diferença significativa nas concentrações pós-descongelamento de espermatozoides totais, móveis ou progressivamente móveis em amostras criopreservadas usando uma diluição de 1:1 com 20% de DMSO ou uma diluição de 1:2 (esperma: criodiluente) com 30% de DMSO (Figura 3). Figura 1: O fluxo de trabalho usado para processamento semiautomatizado de esperma de coral para criopreservação e exemplos de equipamentos móveis usados em campo. (A) Os feixes de gametas de coral são coletados na proporção de feixes de 5 mL sobre 5 mL de FSW e divididos em separar óvulos e espermatozóides (i). Os metadados da colônia são inseridos na folha de dados automática (ii) e a amostra de esperma isolada é avaliada usando análise de esperma assistida por computador (CASA) (iii). Os parâmetros de qualidade do esperma são adicionados à folha de dados automática para calcular a adição de 20% ou 30% de DMSO em FSW (iv), e a amostra diluída é aliquotada em criogeniais com código de barras (v). Os criogenianos são carregados no rack criogênico e digitalizados na folha de dados automática (vi) e, em seguida, resfriados a uma taxa de -20 ° C / min a -80 ° C (vii). As amostras são então temperadas em nitrogênio líquido e transferidas para transportadores secos para transporte para o Banco de Criodiversidade de Taronga (viii). (B) Exemplo das estações CASA (esquerda) e criopreservação (direita) instaladas em um local de campo remoto na sala de aula do Centro de Educação Ambiental de Konomie. (C) Exemplo da estação de criopreservação de alta capacidade baseada em laboratório configurada para operar vários racks criogênicos no Simulador Nacional de Mar do Instituto Australiano de Ciências Marinhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Comparação de duas opções diferentes de lâminas de câmara para medição da concentração de espermatozóides de coral. (A) Comparação das medições de concentração total de espermatozóides em Acropora millepora (n = 3 indivíduos) usando a câmara de contagem Makler e lâminas de câmara de lamínula fixas disponíveis comercialmente. As colunas mostram a média ± EPM.; asteriscos indicam diferença significativa (P = 0,002). (B) Validação da câmara de contagem de Makler usando microesferas de látex disponíveis comercialmente em uma concentração conhecida e configurações padrão de CASA para espermatozóides de coral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Concentrações pós-descongelamento de espermatozoides totais, móveis ou progressivamente móveis em amostras criopreservadas. Comparações pós-descongelamento das concentrações de espermatozóides totais, móveis e progressivamente móveis usando 20% ou 30% de DMSO em FSW para atingir a concentração final de 10% de DMSO para criopreservação. Amostras de n = 3 indivíduos foram divididas em 2 alíquotas cada, com uma alíquota criopreservada com adição de 1:1 de 20% de DMSO e a segunda alíquota diluída a <2 × 109/mL usando FSW para criopreservação com adição de 1:2 (espermatozoide: criodiluente) de 30% de DMSO. As colunas mostram a média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Arquivo Suplementar 1: Arquivo de folha de dados automática do biobanco de corais. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

A via de processamento semiautomatizada descrita neste protocolo permite o processamento eficiente e a criopreservação de espermatozoides de coral para garantir a genética de espécies ameaçadas e apoiar os esforços de restauração e adaptação de recifes. A motivação para o desenvolvimento deste protocolo foi a falta de sistemas existentes adequados aos requisitos de rendimento da criopreservação de espermatozóides de coral e ao uso de criogeniais, uma vez que os sistemas de processamento de alto rendimento para criopreservação de espermatozóides são normalmente baseados em embalagens de amostras em canudos franceses de 0,25 mL ou 0,5 mL21,22. Em comparação, os criogeniais são geralmente usados em pequena escala para processamento de baixo rendimento (por exemplo, criopreservação de amostras de laboratório para pesquisa23,24) ou em sistemas de processamento de alto rendimento para amostras a granel usando equipamentos caros e não portáteis (por exemplo, processamento de cultura de células para a indústria18,25). Também investigamos o potencial de uso de um sistema de decapagem automática para agilizar a remoção e substituição de tampas criogeniais, mas os sistemas estavam disponíveis apenas para criogeniais individuais ou para racks crioviais inteiros, portanto, não forneciam uma solução econômica. Atualmente, existem vários grupos em todo o mundo que estão usando o protocolo de criopreservação desenvolvido por Hagedorn et al.4 para garantir a diversidade genética dos corais, e é importante que esse trabalho continue a se expandir para mais recifes ao redor do mundo. Portanto, uma consideração importante no desenvolvimento do protocolo atual foi a necessidade de utilizar tecnologias econômicas e acessíveis que pudessem ser prontamente implementadas por esses outros grupos e que não fossem proibitivas em termos de custo para novos grupos que desejam iniciar a criopreservação de espermatozóides de coral.

Um componente-chave do protocolo descrito é o manuseio aprimorado de metadados de amostra por meio de planilhas vinculadas no Microsoft Excel. A entrada de dados geralmente é direta, mas deve-se observar que a edição de informações nas planilhas de dados automáticas só deve ser feita excluindo e reinserindo informações, pois funções rápidas (por exemplo, Ctrl + C, Ctrl + V) para editar dados afetarão potencialmente as entradas simultâneas de outros usuários e podem causar problemas com a vinculação de dados entre planilhas. Um componente de metadados importante é um identificador exclusivo (ou seja, ID da colônia) que está vinculado à colônia doadora e que é anexado à amostra em todos os estágios da via de processamento. É essencial que os tubos de amostra sejam claramente rotulados com o ID da colônia no momento da coleta do pacote e que essas informações sejam transcritas com precisão em quaisquer novos tubos para os quais a amostra seja transferida durante a preparação (por exemplo, durante a filtragem para separar óvulos e espermatozóides ou para adição de criodiluente). Embora o protocolo permita a transferência automática de informações de qualidade da amostra do operador CASA para a estação de trabalho de criopreservação, podem ser encontrados problemas quando a cobertura de internet ou Wi-Fi é ruim. Se forem encontrados atrasos na transferência de dados, é recomendável que as duas estações de trabalho trabalhem offline e mantenham folhas de dados automáticas separadas que possam ser reconciliadas posteriormente. As principais informações exigidas pelo operador de criopreservação são o ID da colônia e a concentração da amostra, portanto, é recomendável que o operador CASA escreva a concentração da amostra no tubo de amostra como um backup para garantir que essas informações estejam disponíveis para a preparação da criopreservação se houver um atraso no upload ou download de metadados entre computadores.

A escolha do leitor de código de barras e dos criogeniais com código de barras usados para este protocolo pode ser variada para se adequar ao orçamento e à disponibilidade do produto; No entanto, existem alguns elementos-chave que devem ser considerados em sua seleção. O leitor de código de barras deve ter a capacidade de configurações personalizadas, especificamente a capacidade de alterar as especificações de entrada de dados e a direção da entrada de dados. As folhas de dados automáticas usadas para este protocolo usam entrada horizontal, mas em algumas ocasiões (por exemplo, acesso ao biobanco ou para outros usos laboratoriais) a entrada vertical pode ser necessária, por isso é importante que esse recurso seja personalizável. Embora o protocolo possa ser usado com códigos de barras 1D e 2D, recomenda-se que os criotubos selecionados tenham um componente legível por humanos (por exemplo, os códigos de barras 1D normalmente incluem um número exclusivo) para permitir a verificação cruzada da entrada da amostra durante a criopreservação. Além da entrada de amostras, o leitor de código de barras pode ser usado para automatizar a entrada de alguns campos de metadados, criando e imprimindo códigos QR para informações repetidas nas amostras (por exemplo, nomes de espécies, datas e locais de recifes) antes da desova. Essas informações podem ser inseridas de forma rápida e fácil nas folhas de dados automáticas, digitalizando com o leitor de código de barras. Além disso, ao anexar códigos de barras de número de série a cada rack criogênico e sonda de termopar, também é possível vincular cada execução de criopreservação a um conjunto específico de equipamentos dentro do banco de dados, o que é útil para controle de qualidade e para identificar componentes que requerem reparo ou substituição.

Os fatores limitantes no processamento são muitas vezes o tempo gasto esperando que os feixes se quebrem e o tempo necessário para filtrar e separar o esperma dos óvulos antes do CASA e da criopreservação. Sempre que possível, recomenda-se processar as amostras na ordem em que os feixes se quebram; no entanto, ganhos adicionais de eficiência podem ser obtidos por meio do gerenciamento estratégico de pedidos de processamento de amostras. Por exemplo, se houver 5 ou menos criogeniais por colônia devido a baixos volumes de amostra (ou seja, menos de 3 mL de espermatozóides por colônia) ou baixa concentração de espermatozóides que requerem uma diluição de 2:1 com criodiluente (ou seja, menos de 2 × 109/mL), então é melhor adicionar criodiluente a duas amostras de colônia ao mesmo tempo para que possam ser executadas juntas no mesmo rack criogênico (total # slots disponíveis = 11), em vez de executá-los separadamente com manequins preenchendo os espaços vazios. Além disso, é possível executar vários racks criogênicos simultaneamente (para amostras >6 mL de volume), desde que seja tomado cuidado para garantir que todos os processos possam ser concluídos dentro do tempo de equilíbrio do criodiluente de 10 minutos, o que pode aumentar ainda mais o rendimento da amostra. No entanto, ao executar vários racks criogênicos ou combinar várias colônias em um único rack criogênico, deve-se tomar cuidado para garantir que os metadados de criopreservação sejam atribuídos à amostra correta na folha de dados automática, especialmente se as amostras forem criopreservadas em uma ordem diferente de sua avaliação CASA.

Além do desenvolvimento do fluxo de trabalho semiautomatizado, a presente descrição do protocolo também fornece duas comparações metodológicas relacionadas à concentração de espermatozoides que visam melhorar a análise de espermatozoides e os resultados da criopreservação. Em geral, a coleta de 5 mL de feixes de gametas em 5 mL de água do mar (volume total de 10 mL) resultará em uma concentração de espermatozóides igual ou superior a 2 × 109 células/mL, mas há ocasiões em que a concentração de espermatozoides pode ser menor devido a diferenças de espécies ou feixes que se rompem durante a coleta. O uso de um criodiluente DMSO de concentração mais alta (30% v/v) reduz a quantidade pela qual os espermatozoides são diluídos para ajudar a minimizar a variação de lote para lote na concentração de espermatozoides no criogenial. É importante ressaltar que o uso de 30% de DMSO para atingir a concentração final de DMSO não afeta a concentração pós-descongelamento ou os parâmetros de motilidade, conforme mostrado pelos dados representativos na Figura 3. A segunda comparação metodológica fornece uma alternativa às lâminas de câmara de lamínula fixa de uso único normalmente usadas para CASA. O principal desafio com o uso de lâminas disponíveis comercialmente para a análise de espermatozóides de coral é que elas podem afetar a precisão da avaliação da motilidade devido à aderência dos espermatozoides ao revestimento da lâmina. O uso da solução de ativação supera esse problema em muitas, mas não em todas as amostras, portanto, ainda é recomendável realizar uma análise CASA separada para motilidade usando uma lâmina simples para garantir confiabilidade e consistência. O uso de uma câmara de contagem de Makler supera a necessidade de analisar a concentração e a motilidade separadamente e, potencialmente, melhora a precisão das medidas de concentração (Figura 2), por isso é recomendado para uso com o protocolo atual. Dada essa discrepância nas medições de concentração, um achado que foi relatado anteriormente20, é importante sempre registrar os detalhes da lâmina no banco de dados juntamente com os dados de qualidade do esperma e, sempre que possível, ser consistente no tipo de lâmina da câmara usada para minimizar a variação de lote para lote e ajudar a garantir cálculos confiáveis das proporções espermatozoide: óvulo para fertilizações.

O processo semiautomatizado aqui descrito fornece um caminho padronizado e eficiente para criopreservação e biobanco de espermatozóides de espécies de corais ameaçadas, mantendo a biossegurança e a qualidade da amostra. O protocolo descrito é facilmente transferível e relativamente barato para implementar em programas em todo o mundo que estão trabalhando para garantir a diversidade de corais existente usando a criopreservação, que será essencial para prevenir extinções e maximizar os recursos disponíveis para os esforços de restauração de recifes agora e no futuro.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos Proprietários Tradicionais de Konomie, o povo Woppaburra, pela permissão para testar o sistema descrito neste artigo durante a desova no país em novembro de 2022, e ao Centro de Educação Ambiental de Konomie pelo uso de suas instalações. Também gostaríamos de agradecer o apoio da equipe e dos cientistas do Instituto Australiano de Ciências Marinhas que facilitaram a coleta e desova de colônias no National Sea Simulator. Este trabalho foi realizado como uma atividade do subprograma de Criopreservação (RRAP-CP-01) para o Programa de Restauração e Adaptação de Recifes, uma parceria entre o Reef Trust do governo australiano e a Great Barrier Reef Foundation, com apoio adicional da Taronga Conservation Society Australia, da Taronga Conservation Science Initiative e de outros filantropos que apoiam a Taronga Foundation.

Materials

Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller – Aliquotting pipette Vistalab 2100-1005 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
5 mL serological pipettes (bulk) Thermo Scientific  Nunc 170355 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
10 mL serological pipettes (bulk) Thermo Scientific Nunc  170356 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
P2 0.2–2 µL pipettor Gilson F144054M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P10 1–10 µL pipettor Gilson F144055M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P20 2–20 µL pipettor Gilson  F144056M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P200 20–200 µL pipettor Gilson F144058M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P1000 100–1000 µL pipettor Gilson F144059M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
Vacuum pump Millipore WP6122050 Preparation of filtered sea water for solution preparation
Reusable bottle-top filtration system Thermo Scientific DS0320-5045 Preparation of filtered sea water for solution preparation
0.22-µm filter discs, mixed cellulose esters  Merck Millipore GSWP04700 Preparation of filtered sea water for solution preparation
Filtered sea water N/A – Base medium for sperm activation and cryoprotectant solutions
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 Cryoprotectant chemical used at a final concentration of 10% v/v in filtered seawater for sperm cryopreservation
Caffeine Sigma-Aldrich C0750 Used to activate sperm motility
BSA heat shock fraction Sigma-Aldrich A9647 Used to minimise sperm adherance to CASA well slides
15-mL tubes – racked Thermo Scientific 339651 Preparation of sperm activation solution
50-mL tubes racked Thermo Scientific 339653 For collection of gamete bundles and filtered sperm samples
Transfer pipettes Thermo Scientific Samco 202PK To aid collection of gamete bundles from the water surface
100-µm filter baskets Fisher Scientific 22363549 To exclude eggs during separation of the sperm sample
Eppendorf racks Interpath 511029 Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Eppendorf 1.5-mL tube Eppendorf 30120086 Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Glass coverslips 18×18 mm Brand 4700 45 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Plain glass slides, precleaned, 75×25 mm Corning 2947 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Haemocytometer Hausser Scientific 1492 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
CASA slides (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B) IMV Technologies 025107 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Makler sperm counting chamber (CASA) IVFStore SM-373 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
accu-bead® counting beads Hamilton-Thorne 710111 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
CASA system + laptop Hamilton Thorne Ceros II Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Safety Glasses Generic – Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Lab coat Long sleeve, full length – Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Cryogloves (pair) Tempshield Mid-Arm Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Medium forceps Generic – For removing cryopreserved samples from the cryo racks and manipulating samples in liquid nitrogen
Barcode scanner (2D compatible) Zebra DS2278 For reading 1D and 2D barcodes on cryovials for sample management
2.0-mL CryoStorage Vial, external thread, pre-capped, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), linear and human readable Eppendorf 30079434 Barcoded cryovials for cryopreservation of sperm samples
Cryovial rack Simport T315 Rack to hold cryovials, with locking base to allow for one hand de-capping and capping
Freezing racks Custom – Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing rack lid Custom – Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container Isosteel  VA-9683  Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Lab timers Generic – For timing of cryoprotectant equilibration prior to cryopreservation
Nitrogen bath 9L BelArt M16807-9104 For quenching samples during cryopreservaton and holding samples during sorting and handling
Thermocouple data logger- multichannel Omega HH520 Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Thermocouple probe – Type K Omega 5SC-TT-K-30-36 Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Cryo pens/coloured permanent pen Staedtler Lumocolor 318 Optional for marking cryovial lids to assist with sample management
Dry Shipper – charged Taylor Wharton CXR100, or CX500 For transfer of cryopreserved samples from field/collection sites to the biorepository for storage
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References

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Daly, J., Hobbs, R., Zuchowicz, N., Hagedorn, M., O’Brien, J. K. A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture. J. Vis. Exp. (208), e66233, doi:10.3791/66233 (2024).
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