JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Een semi-geautomatiseerde workflow voor de cryopreservatie van koraalsperma ter ondersteuning van biobanking en aquacultuur

Published: June 07, 2024
doi:
10.3791/66233
, , , ,
1Taronga Institute of Science and Learning,Taronga Conservation Society Australia, 2School of Biological, Earth and Environmental Sciences,University of New South Wales, 3Department of Mechanical Engineering,University of Minnesota, 4Hawaii Institute of Marine Biology,University of Hawaii, 5Smithsonian National Zoo and Conservation Biology Institute

Summary

Dit protocol beschrijft een semi-geautomatiseerde route om de efficiëntie en capaciteit van de verwerking en cryopreservatie van sperma van bedreigde koraalsoorten te verbeteren, met als doel de genetische diversiteit veilig te stellen en de inspanningen voor rifherstel te ondersteunen.

Abstract

Koraalriffen worden geconfronteerd met een crisis nu de frequentie van verbleking als gevolg van de opwarming van de oceaan toeneemt, wat resulteert in de dood van koralen op riffen over de hele wereld. Het daaropvolgende verlies van genetische diversiteit en biodiversiteit kan het vermogen van koraal om zich aan te passen aan het veranderende klimaat verminderen, dus inspanningen om de bestaande diversiteit te behouden zijn essentieel om de beschikbare middelen voor rifherstel nu en in de toekomst te maximaliseren. De meest effectieve aanpak om genetica op lange termijn veilig te stellen, is cryopreservatie en biobanking, waardoor levende monsters voor onbepaalde tijd bevroren kunnen worden opgeslagen bij cryogene temperaturen in vloeibare stikstof. Cryopreservatie van koraalsperma is sinds 2012 mogelijk, maar het seizoensgebonden karakter van de reproductie van koraal betekent dat biobankactiviteiten beperkt zijn tot slechts een paar nachten per jaar wanneer het paaien plaatsvindt. Het verbeteren van de efficiëntie van workflows voor de verwerking van koraalsperma en cryopreservatie is daarom essentieel om deze beperkte biobankmogelijkheden te maximaliseren. Daartoe wilden we de verwerkingsroutes voor cryopreservatie voor koraalsperma optimaliseren door voort te bouwen op bestaande technologieën en een semi-geautomatiseerde aanpak te creëren om de beoordeling, behandeling en cryopreservatie van koraalsperma te stroomlijnen. Het proces, dat computerondersteunde sperma-analyse, cryovials met streepjescode en een reeks gekoppelde automatische datasheets combineert voor gelijktijdige bewerking door meerdere gebruikers, verbetert de efficiëntie van zowel de monsterverwerking als het metadatabeheer in het veld. Door integratie met transversale onderzoeksprogramma’s zoals het Reef Restoration and Adaptation Program in Australië, kan cryopreservatie een cruciale rol spelen in grootschalige rifherstelprogramma’s door het genetisch beheer van aquacultuurpopulaties te vergemakkelijken, onderzoek te ondersteunen om de thermische tolerantie te verbeteren en het uitsterven van koraalsoorten te voorkomen. De beschreven procedures zullen worden gebruikt voor beoefenaars van cryopreservatie van koraal en biobanking op riffen over de hele wereld en zullen een model bieden voor de overgang van cryopreservatietechnologieën van onderzoekslaboratoria naar grootschalige toepassingen.

Introduction

Koraalriffen ervaren wereldwijd een verlies van koraalsoorten, populaties en genetische diversiteit als gevolg van de opwarming en verzuring van de oceaan als gevolg van klimaatverandering, waardoor de levensvatbaarheid van deze kritieke habitats afneemt en de soorten die ze ondersteunenworden beïnvloed 1,2. De meest effectieve aanpak om genetica op lange termijn veilig te stellen, is cryopreservatie en biobanking, waardoor levende monsters voor onbepaalde tijd bevroren kunnen worden opgeslagen bij cryogene temperaturen in vloeibare stikstof3. De ontwikkeling in 2012 van methoden voor de cryopreservatie van koraalsperma4 maakte voor het eerst de biobanking van genetica van deze soorten mogelijk en leidde in 2012 tot de ontwikkeling van de eerste biorepository voor koraalgenetica5. Sindsdien is dit cryopreservatieprotocol verder verfijnd6 en gebruikt om de genetica van meer dan 50 soorten koraal wereldwijd veilig te stellen, waarvan 30 soorten afkomstig zijn van het Great Barrier Reef in Australië7. Gecryopreserveerd koraalsperma kan gezonde koralen genereren die zich normaal ontwikkelen en zijn gebruikt om experimenten met geassisteerde genenstroom in Australië8 en het Caribisch gebied9 te vergemakkelijken. Hoewel er momenteel technologieën in ontwikkeling zijn om de cryopreservatie van complexe weefseltypes zoals larven10 en volwassen koraalweefsels 11,12 mogelijk te maken, is cryopreservatie van koraalsperma momenteel het meest gevestigde hulpmiddel dat beschikbaar is voor routinematig biobankieren van koraalgenetica.

Naarmate de impact op koraalpopulaties is toegenomen, hebben verschillende landen grootschalige programma’s opgestart om het herstel en de aanpassing van riffen te ondersteunen (bijv. het Reef Restoration and Adaptation Program [RRAP] in Australië13) of om de resterende bedreigde koraalpopulaties veilig te stellen (bijv. Florida Coral Rescue in de VS14). In de context van deze programma’s kan cryopreservatie worden gezien als een faciliterende technologie, die onderzoek en grootschalige koraalproductie ondersteunt, naast het veiligstellen van de bestaande genetische diversiteit en het voorkomen van uitsterven. Cryopreservatie van sperma kan een grotere controle over de voortplanting mogelijk maken tussen populaties die fysiek of tijdelijk gescheiden zijn en kan genetisch beheer van de broedvoorraad mogelijk maken om te selecteren op gewenste eigenschappen zoals thermische tolerantie of ziekteresistentie8. Tot op heden is biobanking van koraalsperma op relatief kleine schaal uitgevoerd ter ondersteuning van het beheer van de biodiversiteit7, dus er zal een zekere mate van opschaling nodig zijn als een dergelijke biobanking zijn potentieel binnen deze grotere rifherstelprogramma’s wil benutten. Zoals bij alle inspanningen voor rifherstel op basis van de voortplanting van koraal, is de belangrijkste belemmering voor het verhogen van de inspanningen op het gebied van biobankieren de beperkte periode waarin koraalgameten beschikbaar zijn, aangezien het paaien in de meeste rifbouwende soorten samenvalt met de volle maan in het late voorjaar en de vroege zomer15, wat betekent dat gameten slechts een paar nachten per jaar beschikbaar zijn voor cryopreservatie en biobankieren. Bovendien zijn er in regio’s waar massaal paaien, bijvoorbeeld het Great Barrier Reef, meestal meerdere soorten tegelijkertijd of binnen een paar uur na elkaar op dezelfde nacht paaien15. Verbeteringen aan de cryopreservatieroute van sperma zijn daarom nodig om de schaal en efficiëntie van de verwerking te vergroten om de biobankcapaciteit tijdens deze korte jaarlijkse paaivensters te maximaliseren en tegelijkertijd de integriteit van monsters en bijbehorende metadata te waarborgen.

Cryopreservatie en biobanking van koraalsperma omvatten verschillende belangrijke stappen, van het verzamelen van gameten tijdens het paaien tot de opname van monsters in de biorepository en database (Figuur 1). Het proces begint met het scheiden van sperma uit eieren (bij hermafrodiete soorten) of het verzamelen van sperma uit de waterkolom (bij gonochorische soorten), gevolgd door de beoordeling van de beweeglijkheid en concentratie van het sperma. Sperma wordt vervolgens gecombineerd met cryoprotectant (10% v/v eindconcentratie, dimethylsulfoxide, DMSO) in gefilterd zeewater (FSW) en gekoeld bij -20 °C/min in een op maat ontworpen koelapparaat4. Vroege iteraties van dit proces waren gebaseerd op visuele beoordeling van de beweeglijkheid en concentratie van het sperma via fasecontrastmicroscopie en hemocytometertellingen, het afdrukken en labelen van buizen terwijl monsters werden verwerkt voor cryopreservatie, het met de hand pipetteren van spermamonsters in cryovials en koeling op een speciaal ontworpen drijvend rek16. De toepassing van computerondersteunde spermaanalyse (CASA)17 en de ontwikkeling van een 3D-geprint koelapparaat6 hebben de efficiëntie en betrouwbaarheid van cryopreservatie van koraalsperma verbeterd, maar de verwerkingsroute voor spermamonsters is sinds het begin grotendeels hetzelfde gebleven. Hoewel deze aanpak geschikt is voor het verwerken van monsters van een matig aantal kolonies en soorten tijdens een paainacht, zijn er voor grote hoeveelheden en aantallen kolonies (bijv. individuele monsters van >10 kolonies tegelijk) knelpunten in de cryopreservatieroute die de verwerking van de monsters op een tijdige manier belemmeren (d.w.z. binnen 2 uur na het vrijkomen van het sperma) zonder verslechtering van het vruchtbaarheidspotentieel van het monster. Hoewel er grootschalige vloeistofbehandelingssystemen voor cryovials beschikbaar zijn (bijv. Thomas et al.18), zijn ze doorgaans ontworpen voor verwerking van grote batches (d.w.z. meerdere rekken met cryovials) en zijn ze niet geschikt voor transport en gebruik in het veld, dus ze zijn niet kosteneffectief voor deze toepassing. Daarom was de huidige studie gericht op het verbeteren van de efficiëntie van cryopreservatie van koraalsperma door draagbare, goedkope automatiseringsapparatuur en -methoden te introduceren bij belangrijke stappen in het verwerkingstraject om het aantal monsters dat effectief kan worden gecryopreserveerd tijdens een paainacht te maximaliseren.

Protocol

De hierin beschreven methoden kunnen worden gebruikt om sperma van zowel hermafrodiete als gonochorische koraalsoorten te verwerken en te cryopreservatie. Een algemene inleiding en inleiding over het paaien van koralen en het verzamelen van gameten voor cryopreservatie van sperma voor beide voortplantingsmodi is te vinden op de Smithsonian’s National Zoo & Conservation Biology Institute Coral Cryopreservation Training Course19. De beschreven methoden zijn voornamelijk ontwikkeld met behulp van gameten uit Acropora millepora-kolonies verzameld uit de Keppel Island-groep op Woppaburra Sea Country en uit Davies Reef op Bindal Sea Country, op het Great Barrier Reef in Australië. Alle verzameling en gebruik van koralen en gameten werden uitgevoerd met de vrije voorafgaande en geïnformeerde toestemming van de traditionele beheerders van de relevante zeelanden. De reagentia en apparatuur die voor dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. 1. Pre-spawning – systeemcontroles en bereiding van sperma-activeringsoplossing en cryodiluent Controleer of de streepjescodescanner is opgeladen, actief is en is ingesteld om spreadsheetgegevens in te voeren als horizontale celinvoer. Raadpleeg de gebruikershandleiding van de barcodelezer om deze instelling aan te passen. Bereid geconcentreerde voorraadoplossingen voor de activering van koraalsperma voor CASA.OPMERKING: Wegwerphandschoenen moeten worden gedragen bij het hanteren van chemicaliën voor de bereiding van de activeringsoplossing.Bereid 30% runderserumalbumine (BSA) bouillonoplossing (5 ml) door 1,5 g BSA op te lossen in 4 ml steriel gezuiverd weefselkweekwater met behulp van een buisverwarmer die is ingesteld op 37 °C of door de tube in gevouwen handen te houden, met periodieke zachte werveling (injectieflacon niet schudden). Eenmaal in oplossing, vul aan tot het uiteindelijke volume (5 ml) met weefselkweekwater, label de buis met de datum en markeer “30% BSA in H2O”. Bewaar maximaal 2 weken in de koelkast (4 °C). Bereid 60 mM cafeïnebouillonoplossing (25 ml) door 0,2913 g cafeïne op te lossen in 24 ml gefilterd zeewater (FSW). Eenmaal in oplossing, vul aan tot het uiteindelijke volume (25 ml) met FSW, label de tube met de datum en markeer “60 mM cafeïne in FSW”. Bewaar maximaal 1 maand in de koelkast.OPMERKING: De maximale oplosbaarheid van cafeïne in FSW is ongeveer 71 mM. Bereid werkoplossing voor spermaactivering voor spermamonsters voor bij ~109 sperma/ml (0,9% BSA + 12 mM cafeïne in FSW).Voor een werkoplossing van 10 ml combineert u 2,0 ml cafeïnebouillonoplossing van 60 ml + 0,3 ml 30% BSA-bouillonoplossing + 7,7 ml FSW. Label de tube met datum en “sperma-activatie werkoplossing – 0,9% BSA + 12 mM cafeïne”. Bereid op elke dag van gebruik, bewaar bij kamertemperatuur (19-30 °C) en gooi de ongebruikte oplossing aan het einde van de dag weg. Bereid cryoprotectieve oplossingen (cryodiluerende middelen) voor. Zorg ervoor dat wegwerphandschoenen worden gedragen bij het hanteren van de cryoprotectant DMSO.OPMERKING: FSW wordt bereid met variërende cryoprotectieve concentraties, afhankelijk van de initiële spermaconcentratie in een monster en de gewenste uiteindelijke spermaconcentratie van gecryopreserveerde aliquots. Zorg er bij het bereiden van het cryodiluerende middel voor dat FSW in de buis van 50 ml wordt gedoseerd voordat DMSO wordt toegevoegd.Verzamel ongezuiverd zeewater uit het tanksysteem waarin koralen worden vastgehouden voordat ze paaien (~35 ppt zoutgehalte). Filter ruw zeewater met behulp van een flessendop filtersysteem dat is aangesloten op een vacuümpomp met een niet-pyrogeen membraanfilter van 0,2 μm. Voor een spermaconcentratie ≥2 × 109 sperma/ml, bereidt u 20% DMSO in FSW door 10 ml DMSO + 40 ml FSW in een buisje van 50 ml te combineren. Voor een spermaconcentratie <2 × 109 sperma/ml, bereidt u 30% DMSO in FSW door 15 ml DMSO + 35 ml FSW in een buisje van 50 ml te combineren. Label de buis met de datum en DMSO-concentratie, d.w.z. 30% DMSO of 20% DMSO. Bereid op elke dag van gebruik, bewaar bij kamertemperatuur (19-30 °C) en gooi de ongebruikte oplossing aan het einde van elke dag weg.OPMERKING: Het mengen van DMSO en FSW zorgt voor een exotherme reactie en het cryodiluenmiddel moet ruim voor gebruik worden bijgevuld om afkoeling tot kamertemperatuur mogelijk te maken. FSW kan worden opgeslagen bij 4 °C voor de bereiding van het cryodiluenmiddel om deze warmteontwikkeling tegen te gaan. Bereid de thermokoppel datalogger voor.Om de geschatte afkoelsnelheid van elke cryopreservatierun te meten, plaatst u een cryovial met 10% DMSO in FSW met een thermokoppelsonde die door het deksel wordt ingebracht in een monstersleuf van het cryopreservatierek naast de spermamonsters. Om een thermokoppelflacon te maken, prikt of smelt u een klein gaatje in de dop van de cryovial met streepjescode en steekt u een K-type of T-type thermokoppel door de opening. Duw de punt van de thermokoppelsonde naar beneden tot een niveau zodat deze in het midden van het monster zit wanneer de injectieflacon is gevuld, waarbij u de sondepunt gecentreerd in de injectieflacon houdt om contact met de binnenwand van de injectieflacon te voorkomen. Sluit de dop af en houd de thermokoppelsonde op zijn plaats met hete lijm. Draag wegwerphandschoenen en vul de cryovial met streepjescode met een volume van 10% DMSO in FSW dat gelijk is aan het volume van het spermamonster dat moet worden gecryopreserveerd. Bereid verse 10% DMSO in FSW en vul thermokoppelflacons dagelijks bij. 2. Voorbereiding en beoordeling van sperma Voor hermafrodiete soorten (bijv. Acropora-soorten ), verzamel gametenbundels van het wateroppervlak met behulp van een transferpipet van 3 ml en plaats ze in een gelabelde buis van 50 ml in een verhouding van 5 ml gametenbundels over 5 ml zeewater (totaal volume van 10 ml). Voor gonochorische soorten verzamelt u sperma dicht bij de poliepmond met behulp van een transferpipet van 3 ml en plaatst u het monster in een gelabeld buisje van 50 ml, waarna u direct doorgaat naar stap 2.8.OPMERKING: Wegwerphandschoenen zijn niet nodig voor het verzamelen en hanteren van gametenmonsters, maar kunnen indien gewenst worden gedragen. Handen moeten grondig worden gewassen met zoet water, of handschoenen moeten tussen elk gametenmonster worden verwisseld om kruisbesmetting te voorkomen. Voor hermafrodiete soorten, schud de sperma-eibundels door het monster voorzichtig met de hand rond te draaien totdat de bundels uit elkaar zijn gebroken.OPMERKING: Sommige Montipora-soorten hebben een toxine in de eieren, dus ze moeten langzaam uit elkaar vallen met minimale opschudding om beschadiging van sperma te voorkomen. Laat het monster 2 minuten in een buizenrek zitten om de eieren naar de oppervlakte te laten drijven en het sperma te laten bezinken (eieren vormen een roze/bruine laag aan het oppervlak en individuele eieren zijn zichtbaar; zie figuur 1i). Om het sperma te scheiden en besmette eieren te verwijderen, zuigt u het sperma voorzichtig op van de bodem van de buis met behulp van een schone transferpipet van 3 ml. Breng het spermamonster over naar een celzeef van 100 μm die bovenop een nieuwe steriele centrifugebuis van 50 ml zit. Het monster moet gemakkelijk door het filter kunnen stromen. Tik op het filter om de monsterstroom te stimuleren, en indien nodig kan een schone transferpipet worden gebruikt om eventueel achtergebleven monster van de onderkant van het filter op te vangen. Verwijder het filter en sluit de buis losjes af om luchtverversing mogelijk te maken. Label het gefilterde spermamonster met kolonie-ID en verplaats het monster naar het werkstation voor spermabeoordeling. Open het auto-datasheetbestand van coral biobanking (aanvullend bestand 1). Voer op het tabblad spermabeoordeling de metadata van de koraalkolonie in (kolommen A-H). Bereid sperma voor op CASA-beoordeling.Meng het spermamonster goed en verwijder een aliquot van 10 μl in een lege microcentrifugebuis van 1,8 ml. Voeg onmiddellijk 0,390 ml sperma-activerende werkoplossing druppelsgewijs toe over 10-20 s, en meng het sperma voorzichtig door de oplossing. Dit geeft een verdunningsverhouding van 1:39 (sperma: oplossing, v/v) (of verdunningsfactor van 40), wat een geschikte concentratie biedt voor CASA-beoordeling (~50 × 106/ml) als de concentratie van onbewerkt sperma ~2 × 109 sperma/ml is. Keer de buis 5 keer om en tik op het deksel van de buis voordat u deze opent om de oplossing in de bodem van de buis te laten bezinken.OPMERKING: De spermaconcentratie voor CASA moet tussen 8-50 × 106/ml liggen om een nauwkeurige spermatracering mogelijk te maken17. Indien nodig kan extra werkoplossing voor spermaactivering aan de rauwe spermaaliquot worden toegevoegd om de concentratie te verminderen. Bereken de verdunningssnelheid opnieuw en voer deze waarde in de spreadsheet in. In gevallen waarin veel monsters tegelijkertijd moeten worden verwerkt, kunnen de microcentrifugebuisjes van 1,8 ml vooraf worden geladen met 0,390 ml sperma-activerende werkoplossing met het aliquot van 10 μl spermamonster er rechtstreeks aan toegevoegd, en vervolgens goed gemengd door de buis 10× om te keren en het buisdeksel te tikken voordat u het opent. Beoordeel de beweeglijkheid van het sperma en de concentratie van het geactiveerde monster met behulp van computerondersteunde spermaanalyse (CASA) zoals beschreven in Zuchowicz et al.17 door 4 μL geactiveerde spermasuspensie op een Makler-telkamer20 te plaatsen of door visuele beoordeling en hemocytometertelling onder fasecontrastmicroscopie zoals beschreven in Hagedorn et al.4.NOTITIE: De Makler-kamer en het dekglaasje moeten goed worden gereinigd met 70% ethanol, vervolgens gedestilleerd water en tussen de monsters worden afgeveegd met een pluisvrij doekje. Voer de spermaverdunningsfactor in die wordt gebruikt voor CASA-beoordeling en voer CASA-outputs in voor spermaconcentratie (ml/ml), totale beweeglijkheid (%) en progressieve beweeglijkheid (%) in het automatische gegevensblad.OPMERKING: Aanvullende CASA-metrieken, waaronder gemiddelde padsnelheid (VAP), rechtuitsnelheid (VSL) en kromlijnige snelheid (VCL) kunnen optioneel worden opgenomen in het automatische gegevensblad of later worden opgehaald uit opgeslagen CASA-bestanden. Schrijf de spermaconcentratie op het gefilterde spermamonsterbuisje en breng het monster over naar het cryopreservatiewerkstation in dezelfde volgorde als bij het breken en verwerken van de bundel. 3. Spermaverdunning en cryoprotectieve evenwicht Open op het cryopreservatiewerkstation hetzelfde auto-datasheet-bestand met koraalbiobanking dat het werkstation voor spermabeoordeling gebruikt en selecteer het tabblad Cryopreservatie . Controleer het etiket van de spermamonsterbuis en identificeer de bijbehorende vermelding door Colony ID (kolom C) te controleren. Als u niet tegelijkertijd toegang heeft tot hetzelfde automatische gegevensbladbestand tussen werkstations, voert u handmatig gegevens in de kolonie-ID (kolom C) en spermaconcentratie (kolom F) in het automatische gegevensblad in. Meet met een serologische pipet het volume van het spermamonster door het monster in de pipet te trekken en terug in dezelfde buis te persen; vul de waarde in kolom E in. Controleer de automatisch berekende kolom I voor de vereiste cryoprotectieve concentratie en kolom H voor het volume cryodiluent dat moet worden toegevoegd (tabel 1). Start een timer van 10 minuten en begin met behulp van een serologische pipet onmiddellijk met het druppelsgewijs toevoegen van het cryodiluans, met een constante zachte menging van het monster, waarbij u ervoor zorgt dat wegwerphandschoenen worden gedragen voor DMSO-behandeling. Noteer de additietijd van het cryodiluentiemiddel in kolom P. Sperma concentratie Cryodiluens Verdunningsverhouding (sperma:cryodiluent) Uiteindelijke DMSO-concentratie in spermamonster (%) < 2 × 109/ml 30% DMSO in FSW 2:1 10% ≥ 2 × 109/ml 20% DMSO in FSW 1:1 10% Tabel 1: Cryodiluentieconcentratie en verdunningsverhoudingen voor cryopreservatie van koraalsperma, gebaseerd op beoordeling van de totale spermaconcentratie in het te cryopreservatie te cryopreservatie monster. 4. Cryopreservatie van sperma Lees kolom K om te bepalen hoeveel cryovials u moet vullen. Dit wordt automatisch berekend op basis van het totale volume sperma en het gewenste volume per injectieflacon (in de meeste gevallen 1 ml). Doorloop tijdens de incubatietijd van 10 minuten de stappen 4.2 tot en met 4.6. Verwijder de dop van steriele cryovials met barcode en plaats de doppen op een schoon/steriel oppervlak. Optioneel: Schrijf de run # op elke cryovial met behulp van een permanente marker; Dit kan helpen bij een snelle identificatie van monsters voor toetreding tot de biobank. Met behulp van een serologische pipet en een aliquoting pipettor die is ingesteld op het gewenste monstervolume (1 ml), aliquot monsters in cryovials zonder barcode en recap flacons. Plaats één thermokoppelflacon en alle volle monsterflacons op een leeg cryorek bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat het oppervlak met de barcode op alle injectieflacons naar buiten wijst. Plaats indien nodig extra dummy cryovials met 10% DMSO in FSW in eventuele lege ruimtes op het cryorek om ervoor te zorgen dat alle ruimtes bezet zijn. Voer het runnummer in de auto-datasheet (kolom U) in en scan het serienummer van het cryo-rack (QR-code) in kolom V. Plaats de cursor in de juiste cel van kolom Z en scan in de thermokoppelflacon, gevolgd door alle cryoviale buisjes die op het rek zijn geladen (kolom AA en verder). Kantel het rek niet op zijn kant om ervoor te zorgen dat het monster niet in de schroefdraad van de injectieflacon komt. Controleer tijdens het scannen of de gegevens in de juiste cel worden ingevoerd en of alle cryovials één keer zijn gescand. Zet geladen en gescande rekken opzij voor de rest van de cryoprotectieve evenwichtsperiode en bereid het koelvat voor op cryopreservatie. Vul het cryo-rekkoelvat met vloeibare stikstof tot het juiste, vooraf bepaalde niveau dat nodig is voor koeling bij ongeveer -20 °C/min.NOTITIE: Stikstof mag alleen worden gebruikt in goed geventileerde ruimtes, omdat er gevaar voor verstikking bestaat. Schoenen met gesloten neus, veiligheidsbrillen/gelaatsschermen en cryohandschoenen moeten worden gedragen bij het hanteren van vloeibare stikstof. Raadpleeg de institutionele richtlijnen voor specifieke informatie over de behandeling en het gebruik van vloeibare stikstof. Aan het einde van de cryoprotectant-equilibratieperiode van 10 minuten sluit u de thermokoppelsonde aan op de datalogger en begint u met opnemen, plaatst u vervolgens voorzichtig het volledige cryorek in het koelvat en plaatst u het deksel. Noteer de starttijd in kolom Q. Zodra de thermokoppelflacon -80 °C of lager aangeeft op de datalogger, blust u de monsters in vloeibare stikstof door het cryo-rekinzetstuk over te brengen naar een vloeibaar stikstofbad in een apart vat, zoals een polystyreendoos. Haal de cryovials uit het rek en breng ze over naar een droge verzender voor transport naar de biorepository.

Representative Results

De stappen die in dit protocol worden beschreven, bouwen voort op de oorspronkelijke methoden voor cryopreservatie van koraalsperma zoals beschreven door Hagedorn et al.4 en de daaropvolgende verfijning door Zuchowicz et al.6, en bieden belangrijke verbeteringen om de efficiëntie van spermaverwerking voor cryopreservatie en biobanking te vergroten. Het gebruik van cryovials met barcode en een aliquoting auto-pipettor vereenvoudigt de procedure voor het verpakken van sperma door de noodzaak om cryovials te printen en met de hand te labelen weg te nemen, en vermindert de belasting van het met de hand pipetteren van grote aantallen monsters. Belangrijk is dat deze verbeteringen ook de tijd verkorten die nodig is voor de voorbereiding van het monster voor cryopreservatie, van ongeveer 8-10 minuten tot minder dan 5 minuten. Samen met het gebruik van CASA verminderen deze verbeteringen het aantal personeelsleden dat nodig is voor efficiënte biobanking van koraalsperma, van 4 naar 6 in de oorspronkelijke methoden, tot slechts twee personen die het huidige protocol gebruiken. Bovendien betekent het gebruik van cryovials met streepjescode dat elke buis een unieke identificatiecode heeft, zodat elke buis binnen de database kan worden gevolgd met een hogere resolutie dan de vorige methode met behulp van batch-geprinte labels. Veldtests van het protocol tijdens twee paaigebeurtenissen tijdens het paaiseizoen van het Great Barrier Reef in Australië in 2022 resulteerden in de cryopreservatie en biobanking van 389 monsters van 57 kolonies van 5 soorten door twee operators (één persoon voor CASA, één persoon voor cryopreservatie), met één extra persoon die assisteerde bij het uiteenvallen van de bundel en het scheiden van sperma indien nodig. Tijdens het paaievenement in november 2022 op Konomie (North Keppel Island) in Queensland, Australië, werden 150 monsters van 24 kolonies van Acropora millepora gecryopreserveerd door twee operators gedurende een periode van 2 uur. De efficiënte verwerking en cryopreservatie van deze hoeveelheid monsters van zo’n groot aantal koraalkolonies werd voornamelijk mogelijk gemaakt door de efficiëntie die werd behaald in de voorbereidingstijd van het monster en de vereenvoudigde overdracht van metadata tussen werkstations. Verdere tests van de workflow tijdens het paaien in december 2023 stelden vast dat de Makler-telkamer voor koraalsperma nauwkeurigere motiliteits- en concentratiegegevens opleverde in vergelijking met in de handel verkrijgbare objectglaasjes voor eenmalig gebruik met vaste dekglaasjes die vaak worden gebruikt met CASA-systemen. De Makler-telkamer werd gevalideerd voor CASA met behulp van in de handel verkrijgbare latexmicrobeads in een bekende concentratie met een monstervolume van 4 μL en de standaard CASA-instellingen17 die worden gebruikt voor koraalsperma. Deze analyses toonden consistente tellingen met een lage variabiliteit (44,5 ± 0,7 miljoen/ml) die binnen het verwachte concentratiebereik (46,0 ± 7,0 miljoen/ml) van de fabrikant vielen (figuur 2). Een vergelijking van CASA-gegevens voor Acropora millepora verzameld met behulp van de Makler-telkamer en de objectglaasjes met vaste dekslipkamer vond een significant verschil in het aantal spermaconcentraties tussen de twee kamertypen (P = 0,002; Figuur 2), waarbij de objectglaasjes van de vaste dekglaasjes minder dan de helft van de concentratie registreren die is bepaald met behulp van de Makler-telkamer. Deze trend werd ook waargenomen in spermamonsters van twee andere koraalsoorten (gegevens niet getoond). Tests in december 2023 vonden ook geen significant verschil in de concentraties na dooi van totaal, beweeglijk of progressief beweeglijk sperma in monsters die gecryopreserveerd waren met behulp van een 1:1 verdunning met 20% DMSO of een 1:2 verdunning (sperma: cryodiluent) met 30% DMSO (Figuur 3). Figuur 1: De workflow die wordt gebruikt voor semi-geautomatiseerde verwerking van koraalsperma voor cryopreservatie en voorbeelden van mobiele apparatuur die in het veld wordt gebruikt. (A) Koraalgametenbundels worden verzameld in een verhouding van 5 ml bundels over 5 ml FSW en gebroken om eieren en sperma te scheiden (i). Metagegevens van de kolonie worden ingevoerd in het automatische gegevensblad (ii) en het geïsoleerde spermamonster wordt beoordeeld met behulp van computerondersteunde spermaanalyse (CASA) (iii). Parameters voor de spermakwaliteit worden toegevoegd aan het automatische gegevensblad om de toevoeging van 20% of 30% DMSO in FSW (iv) te berekenen, en het verdunde monster wordt gealiquoteerd in cryovials met streepjescode (v). De cryovials worden op het cryorek geladen en gescand in de auto-datasheet (vi) en vervolgens afgekoeld met een snelheid van -20 °C/min tot -80 °C (vii). De monsters worden vervolgens geblust in vloeibare stikstof en overgebracht naar droge verladers voor transport naar de Taronga CryoDiversity Bank (viii). (B) Voorbeeld van de CASA- (links) en cryopreservatiestations (rechts) die zijn opgesteld op een afgelegen veldlocatie in het klaslokaal van het Konomie Environmental Education Centre. (C) Voorbeeld van het in het laboratorium gevestigde cryopreservatiestation met hoge capaciteit dat is opgezet om meerdere cryo-rekken te laten draaien bij het Australian Institute of Marine Science National Sea Simulator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Vergelijking van twee verschillende opties voor het meten van de concentratie van koraalsperma. (A) Vergelijking van metingen van de totale spermaconcentratie in Acropora millepora (n = 3 individuen) met behulp van de Makler-telkamer en in de handel verkrijgbare vaste dekglaasjes. Kolommen tonen de gemiddelde ± SEM.; sterretjes geven een significant verschil aan (P = 0,002). (B) Validatie van de Makler-telkamer met behulp van in de handel verkrijgbare latexmicrobeads met een bekende concentratie en standaard CASA-instellingen voor koraalsperma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Concentraties na ontdooiing van totaal, beweeglijk of progressief beweeglijk sperma in ingevroren monsters. Vergelijkingen na dooi van totale, beweeglijke en progressief beweeglijke spermaconcentraties met behulp van 20% of 30% DMSO in FSW om de uiteindelijke DMSO-concentratie van 10% voor cryopreservatie te bereiken. Monsters van n = 3 individuen werden elk opgesplitst in 2 aliquots, waarbij één aliquot werd gecryopreserveerd met een 1:1 toevoeging van 20% DMSO en het tweede aliquot verdund tot <2 × 109/ml met behulp van FSW voor cryopreservatie met een 1:2 toevoeging (sperma: cryodiluent) van 30% DMSO. Kolommen tonen de gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullend bestand 1: Coral biobanking auto-datasheet bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De semi-geautomatiseerde verwerkingsroute die in dit protocol wordt beschreven, maakt de efficiënte verwerking en cryopreservatie van koraalsperma mogelijk om genetica van bedreigde soorten veilig te stellen en rifherstel en aanpassingsinspanningen te ondersteunen. De motivatie voor de ontwikkeling van dit protocol was het ontbreken van bestaande systemen die geschikt waren voor de doorvoervereisten van cryopreservatie van koraalsperma en het gebruik van cryovials, aangezien verwerkingssystemen met hoge doorvoer voor cryopreservatie van sperma doorgaans gebaseerd zijn op monsterverpakkingen in Franse rietjes van 0,25 ml of 0,5 ml21,22. Ter vergelijking: cryovials worden over het algemeen op kleine schaal gebruikt voor verwerking met een lage doorvoer (bijv. cryopreservatie van laboratoriummonsters voor onderzoek23,24), of in verwerkingssystemen met een hoge doorvoer voor bulkmonsters met behulp van dure, niet-draagbare apparatuur (bijv. celcultuurverwerking voor de industrie 18,25). We hebben ook het potentieel onderzocht voor het gebruik van een automatisch dekappingsysteem om het verwijderen en vervangen van cryoviale doppen te stroomlijnen, maar systemen waren alleen beschikbaar voor individuele cryovials of voor hele cryoviale rekken, dus ze boden geen kosteneffectieve oplossing. Momenteel zijn er wereldwijd verschillende groepen die het cryopreservatieprotocol van Hagedorn et al.4 gebruiken om de genetische diversiteit van koralen veilig te stellen, en het is belangrijk dat dit werk zich blijft uitbreiden naar meer riffen over de hele wereld. Daarom was een belangrijke overweging bij de ontwikkeling van het huidige protocol de noodzaak om kosteneffectieve en toegankelijke technologieën te gebruiken die gemakkelijk door deze andere groepen konden worden geïmplementeerd en die niet onbetaalbaar zouden zijn voor nieuwe groepen die wilden beginnen met cryopreservatie van koraalsperma.

Een belangrijk onderdeel van het beschreven protocol is de verbeterde verwerking van voorbeeldmetadata via gekoppelde spreadsheets in Microsoft Excel. Gegevensinvoer is over het algemeen eenvoudig, maar er moet worden opgemerkt dat het bewerken van informatie in de automatische gegevensbladen alleen mag worden gedaan door informatie te verwijderen en opnieuw in te voeren, aangezien snelle functies (bijv. Ctrl + C, Ctrl + V) om gegevens te bewerken mogelijk van invloed zijn op gelijktijdige invoer door andere gebruikers en problemen kunnen veroorzaken met het koppelen van gegevens tussen spreadsheets. Een belangrijke metadatacomponent is een unieke identificatiecode (namelijk kolonie-ID) die is gekoppeld aan de donorkolonie en die in alle stadia van het verwerkingstraject aan het monster wordt gekoppeld. Het is van essentieel belang dat de monsterbuisjes duidelijk worden geëtiketteerd met de kolonie-ID op het moment van bundelverzameling, en dat deze informatie nauwkeurig wordt getranscribeerd op alle nieuwe buisjes waarin het monster tijdens de bereiding wordt overgebracht (bijv. tijdens het filteren om eieren en sperma te scheiden, of voor toevoeging aan cryodiluentie). Hoewel het protocol de automatische overdracht van informatie over de monsterkwaliteit van de CASA-operator naar het cryopreservatiewerkstation mogelijk maakt, kunnen er problemen optreden wanneer de internet- of wifi-dekking slecht is. Als er vertragingen optreden bij de gegevensoverdracht, wordt aanbevolen dat de twee werkstations offline werken en afzonderlijke automatische gegevensbladen bijhouden die achteraf kunnen worden afgestemd. De belangrijkste informatie die de cryopreservatie-operator nodig heeft, is de kolonie-ID en de monsterconcentratie, dus het wordt aanbevolen dat de CASA-operator de monsterconcentratie op de monsterbuis schrijft als back-up om ervoor te zorgen dat deze informatie bij de hand is voor cryopreservatievoorbereiding als er een vertraging is bij het uploaden of downloaden van metadata tussen computers.

De keuze van de barcodescanner en cryovials met barcode die voor dit protocol worden gebruikt, kan worden gevarieerd om te voldoen aan het budget en de productbeschikbaarheid; Er zijn echter enkele belangrijke elementen waarmee rekening moet worden gehouden bij hun selectie. De barcodescanner moet de capaciteit hebben voor aangepaste instellingen, met name de mogelijkheid om de specificaties voor gegevensinvoer en de richting van gegevensinvoer te wijzigen. De automatische gegevensbladen die voor dit protocol worden gebruikt, maken gebruik van horizontale invoer, maar in sommige gevallen (bijv. toegang tot de biobank of voor ander laboratoriumgebruik) kan verticale invoer vereist zijn, dus het is belangrijk dat deze functie aanpasbaar is. Hoewel het protocol kan worden gebruikt met zowel 1D- als 2D-barcodes, wordt aanbevolen dat de geselecteerde cryovials een voor mensen leesbare component hebben (bijv. 1D-barcodes bevatten meestal een uniek nummer) om kruiscontrole van de monsterinvoer tijdens cryopreservatie mogelijk te maken. Naast het invoeren van monsters, kan de barcodescanner worden gebruikt om de invoer van sommige metadatavelden te automatiseren door QR-codes te maken en af te drukken voor informatie die wordt herhaald in monsters (bijv. soortnamen, datums en riflocaties) voorafgaand aan het paaien. Deze informatie kan vervolgens snel en eenvoudig in de auto-datasheets worden ingevoerd door te scannen met de barcodescanner. Door barcodes met serienummers aan elk cryo-rek en thermokoppelsonde toe te voegen, is het bovendien ook mogelijk om elke cryopreservatierun te koppelen aan een specifieke set apparatuur in de database, wat handig is voor kwaliteitscontrole en om componenten te identificeren die moeten worden gerepareerd of vervangen.

De beperkende factoren bij de verwerking zijn vaak de tijd die wordt besteed aan het wachten tot bundels uiteenvallen en de tijd die nodig is om het sperma van de eieren te filteren en te scheiden voorafgaand aan CASA en cryopreservatie. Waar mogelijk wordt aanbevolen om monsters te verwerken in de volgorde waarin bundels uiteenvallen; Verdere efficiëntiewinsten kunnen echter worden behaald door het strategisch beheer van monsterverwerkingsorders. Als er bijvoorbeeld 5 of minder cryovialen per kolonie zijn vanwege lage monstervolumes (d.w.z. minder dan 3 ml sperma per kolonie) of een lage spermaconcentratie die een verdunning van 2:1 met cryodiluent vereist (d.w.z. minder dan 2 × 109/ml), dan is het beter om cryodiluens tegelijkertijd aan twee koloniemonsters toe te voegen, zodat ze samen op hetzelfde cryorek kunnen worden uitgevoerd (totaal # beschikbare slots = 11), in plaats van ze apart uit te voeren met dummy’s die de lege ruimtes opvullen. Bovendien is het mogelijk om meerdere cryo-rekken tegelijk te laten draaien (voor monsters >6 ml volume), op voorwaarde dat ervoor wordt gezorgd dat alle processen binnen de 10 minuten cryodiluentietijd kunnen worden voltooid, wat de doorvoer van het monster verder kan verhogen. Wanneer u echter meerdere cryo-rekken gebruikt of meerdere kolonies op een enkel cryo-rek combineert, moet ervoor worden gezorgd dat cryopreservatie-metadata worden toegewezen aan het juiste monster in het automatische gegevensblad, vooral als monsters worden gecryopreserveerd in een andere volgorde dan hun CASA-beoordeling.

Naast de ontwikkeling van de semi-geautomatiseerde workflow, biedt de huidige protocolbeschrijving ook twee methodologische vergelijkingen met betrekking tot spermaconcentratie die tot doel hebben de resultaten van spermaanalyse en cryopreservatie te verbeteren. Over het algemeen zal het verzamelen van 5 ml gametenbundels over 5 ml zeewater (totaal volume 10 ml) resulteren in een spermaconcentratie van 2 × 109 cellen/ml of meer, maar er zijn gevallen waarin de spermaconcentratie lager kan zijn als gevolg van soortverschillen of bundels die tijdens het verzamelen uiteenvallen. Het gebruik van een DMSO-cryodiluent met een hogere concentratie (30% v/v) vermindert de hoeveelheid waarmee het sperma wordt verdund om de variatie van batch tot batch in de spermaconcentratie in de cryovial te minimaliseren. Belangrijk is dat het gebruik van 30% DMSO om de uiteindelijke DMSO-concentratie te bereiken geen invloed heeft op de concentratie- of motiliteitsparameters na dooi, zoals blijkt uit de representatieve gegevens in figuur 3. De tweede methodologische vergelijking biedt een alternatief voor de objectglaasjes met vaste dekglaasjes voor eenmalig gebruik die doorgaans voor CASA worden gebruikt. De grootste uitdaging bij het gebruik van in de handel verkrijgbare objectglaasjes voor de analyse van koraalsperma is dat ze de nauwkeurigheid van de motiliteitsbeoordeling kunnen beïnvloeden doordat sperma aan de coating van het objectglaasje blijft kleven. Het gebruik van de activeringsoplossing lost dit probleem op in veel, maar niet alle monsters, dus het wordt nog steeds aanbevolen om een afzonderlijke CASA-analyse uit te voeren op beweeglijkheid met behulp van een gewoon objectglaasje om betrouwbaarheid en consistentie te garanderen. Het gebruik van een Makler-telkamer overwint de noodzaak om concentratie en beweeglijkheid afzonderlijk te analyseren, en verbetert mogelijk de nauwkeurigheid van concentratiemetingen (Figuur 2), dus het wordt aanbevolen voor gebruik met het huidige protocol. Gezien deze discrepantie in concentratiemetingen, een bevinding die eerder is gerapporteerd20, is het belangrijk om altijd de details van de objectglaasjes in de database op te nemen naast de gegevens over de spermakwaliteit en, waar mogelijk, consistent te zijn in het type kamerglaasje dat wordt gebruikt om variatie van batch tot batch te minimaliseren en te helpen zorgen voor betrouwbare berekeningen van sperma: ei-verhoudingen voor bevruchtingen.

Het semi-geautomatiseerde proces dat hierin wordt beschreven, biedt een gestandaardiseerde en efficiënte route voor cryopreservatie en biobanking van sperma van bedreigde koraalsoorten, met behoud van de bioveiligheid en kwaliteit van het monster. Het beschreven protocol is gemakkelijk overdraagbaar en relatief goedkoop te implementeren in programma’s over de hele wereld die werken aan het veiligstellen van de bestaande koraaldiversiteit met behulp van cryopreservatie, wat essentieel zal zijn om uitsterven te voorkomen en de beschikbare middelen voor rifherstelinspanningen nu en in de toekomst te maximaliseren.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken de traditionele eigenaren van Konomie, het Woppaburra-volk, voor de toestemming om het in dit document beschreven systeem uit te proberen tijdens het paaien op het land in november 2022, en het Konomie Environmental Education Centre voor het gebruik van hun faciliteiten. We willen ook de steun erkennen van het personeel en de wetenschappers van het Australian Institute of Marine Science die het verzamelen en paaien van kolonies binnen de National Sea Simulator hebben gefaciliteerd. Dit werk werd uitgevoerd als een activiteit van het subprogramma Cryopreservatie (RRAP-CP-01) voor het Reef Restoration and Adaptation Program, een partnerschap tussen de Australian Government’s Reef Trust en de Great Barrier Reef Foundation, met aanvullende steun van Taronga Conservation Society Australia, het Taronga Conservation Science Initiative en andere filantropen die de Taronga Foundation ondersteunen.

Materials

Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller – Aliquotting pipette Vistalab 2100-1005 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
5 mL serological pipettes (bulk) Thermo Scientific  Nunc 170355 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
10 mL serological pipettes (bulk) Thermo Scientific Nunc  170356 Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
P2 0.2–2 µL pipettor Gilson F144054M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P10 1–10 µL pipettor Gilson F144055M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P20 2–20 µL pipettor Gilson  F144056M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P200 20–200 µL pipettor Gilson F144058M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P1000 100–1000 µL pipettor Gilson F144059M Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
Vacuum pump Millipore WP6122050 Preparation of filtered sea water for solution preparation
Reusable bottle-top filtration system Thermo Scientific DS0320-5045 Preparation of filtered sea water for solution preparation
0.22-µm filter discs, mixed cellulose esters  Merck Millipore GSWP04700 Preparation of filtered sea water for solution preparation
Filtered sea water N/A – Base medium for sperm activation and cryoprotectant solutions
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 Cryoprotectant chemical used at a final concentration of 10% v/v in filtered seawater for sperm cryopreservation
Caffeine Sigma-Aldrich C0750 Used to activate sperm motility
BSA heat shock fraction Sigma-Aldrich A9647 Used to minimise sperm adherance to CASA well slides
15-mL tubes – racked Thermo Scientific 339651 Preparation of sperm activation solution
50-mL tubes racked Thermo Scientific 339653 For collection of gamete bundles and filtered sperm samples
Transfer pipettes Thermo Scientific Samco 202PK To aid collection of gamete bundles from the water surface
100-µm filter baskets Fisher Scientific 22363549 To exclude eggs during separation of the sperm sample
Eppendorf racks Interpath 511029 Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Eppendorf 1.5-mL tube Eppendorf 30120086 Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Glass coverslips 18×18 mm Brand 4700 45 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Plain glass slides, precleaned, 75×25 mm Corning 2947 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Haemocytometer Hausser Scientific 1492 Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
CASA slides (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B) IMV Technologies 025107 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Makler sperm counting chamber (CASA) IVFStore SM-373 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
accu-bead® counting beads Hamilton-Thorne 710111 Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
CASA system + laptop Hamilton Thorne Ceros II Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Safety Glasses Generic – Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Lab coat Long sleeve, full length – Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Cryogloves (pair) Tempshield Mid-Arm Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Medium forceps Generic – For removing cryopreserved samples from the cryo racks and manipulating samples in liquid nitrogen
Barcode scanner (2D compatible) Zebra DS2278 For reading 1D and 2D barcodes on cryovials for sample management
2.0-mL CryoStorage Vial, external thread, pre-capped, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), linear and human readable Eppendorf 30079434 Barcoded cryovials for cryopreservation of sperm samples
Cryovial rack Simport T315 Rack to hold cryovials, with locking base to allow for one hand de-capping and capping
Freezing racks Custom – Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing rack lid Custom – Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container Isosteel  VA-9683  Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Lab timers Generic – For timing of cryoprotectant equilibration prior to cryopreservation
Nitrogen bath 9L BelArt M16807-9104 For quenching samples during cryopreservaton and holding samples during sorting and handling
Thermocouple data logger- multichannel Omega HH520 Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Thermocouple probe – Type K Omega 5SC-TT-K-30-36 Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Cryo pens/coloured permanent pen Staedtler Lumocolor 318 Optional for marking cryovial lids to assist with sample management
Dry Shipper – charged Taylor Wharton CXR100, or CX500 For transfer of cryopreserved samples from field/collection sites to the biorepository for storage
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eakin, C. M., Sweatman, H. P. A., Brainard, R. E. The 2014-2017 global-scale coral bleaching event: Insights and impacts. Coral Reefs. 38 (4), 539-545 (2019).
  2. Anthony, K., et al. New interventions are needed to save coral reefs. Nature Ecology & Evolution. 1 (10), 1-3 (2017).
  3. Wildt, D. E. Genome resource banking for wildlife research, management, and conservation. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 41 (4), 228-234 (2000).
  4. Hagedorn, M., et al. Preserving and using germplasm and dissociated embryonic cells for conserving Caribbean and Pacific coral. PLoS ONE. 7 (3), e33354 (2012).
  5. Hagedorn, M., et al. First frozen repository for the Great Barrier Reef coral created. Cryobiology. 65 (2), 157-158 (2012).
  6. Zuchowicz, N., Daly, J., Lager, C., Williamson, O., Hagedorn, M. Freezing on the beach: A robust coral sperm cryopreservation design. Cryobiology. 101, 135-139 (2021).
  7. Hobbs, R. J., et al. A decade of coral biobanking science in Australia – transitioning into applied reef restoration. Frontiers in Marine Science. , 9 (2022).
  8. Daly, J., et al. Cryopreservation can assist gene flow on the Great Barrier Reef. Coral Reefs. 41, 455-462 (2022).
  9. Hagedorn, M., et al. Assisted gene flow using cryopreserved sperm in critically endangered coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (38), e2110559118 (2021).
  10. Daly, J., et al. Successful cryopreservation of coral larvae using vitrification and laser warming. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
  11. Daly, J., et al. The first proof of concept demonstration of nanowarming in coral tissue. Advanced Sustainable Systems. , (2023).
  12. Powell-Palm, M. J., et al. Cryopreservation and revival of Hawaiian stony corals via isochoric vitrification. Nature Communications. 14, 4859 (2023).
  13. . Reef Restoration and Adaptation Program Available from: https://gbrrestoration.org (2023)
  14. . Florida Coral Rescue Available from: https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue (2023)
  15. Harrison, P. L. . Coral reefs: An ecosystem in transition. , 59-85 (2011).
  16. Hagedorn, M., Carter, V. L. Cryobiology: Principles, species conservation and benefits for coral reefs. Reproduction, Fertility and Development. 28 (8), 1049 (2016).
  17. Zuchowicz, N., et al. Assessing coral sperm motility. Scientific Reports. 11, 61 (2021).
  18. Thomas, D. Evaluation of an automated cryovial dispensing system for cell banking. Genetic Engineering & Biotechnology News. 37 (17), 22-23 (2017).
  19. . Coral cryopreservation training course Available from: https://nationalzoo.si.edu/center-for-species-survival/coral-cryopreservation-training-course (2023)
  20. Bailey, E., et al. Validation of sperm counting methods using limits of agreement. Journal of Andrology. 28 (3), 364-373 (2007).
  21. Hu, E., Yang, H., Tiersch, T. R. High-throughput cryopreservation of spermatozoa of blue catfish (Ictalurus furcatus): Establishment of an approach for commercial-scale processing. Cryobiology. 62 (1), 74-82 (2011).
  22. Pickett, B. W., Berndtson, W. E. Preservation of bovine spermatozoa by freezing in straws: A review. Journal of Dairy Science. 57 (11), 1287-1308 (1974).
  23. Westbrook, C. E., Daly, J., Bowen, B., Hagedorn, M. Cryopreservation of the collector urchin embryo, Tripneustes gratilla. Cryobiology. 15, 104865 (2024).
  24. Maria, A. N., et al. Use of cryotubes for the cryopreservation of Tambaqui fish semen (Colossoma macropomum). Cryobiology. 70 (2), 109-114 (2015).
  25. Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreservation & Biobanking. 21 (1), 106-110 (2023).

Tags

Coral CryopreservationSperm CryopreservationBiobankingCoral Reef RestorationSemi-automated WorkflowComputer-assisted Sperm AnalysisMetadata ManagementGenetic DiversityAquacultureReef Adaptation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Daly, J., Hobbs, R., Zuchowicz, N., Hagedorn, M., O’Brien, J. K. A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture. J. Vis. Exp. (208), e66233, doi:10.3791/66233 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image