O foco deste artigo é detalhar as melhores práticas para a fabricação de meios para microrganismos anaeróbios fastidiosos adquiridos de um ambiente. Esses métodos ajudam a gerenciar culturas anaeróbias e podem ser aplicados para apoiar o crescimento de microrganismos indescritíveis não cultivados, a “matéria escura microbiana”.
A pesquisa de microrganismos anaeróbios dependente da cultura baseia-se na competência metodológica. Esses métodos devem criar e manter condições adequadas de crescimento (por exemplo, pH e fontes de carbono) para microrganismos anaeróbios, ao mesmo tempo em que permitem que as amostras sejam extraídas sem comprometer o ambiente artificial. Para isso, métodos que são informados e simulam um ambiente in situ podem ser de grande auxílio na cultura de microrganismos desse ambiente. Aqui, delineamos um método anaeróbio informado e simulado in situ para cultivo de microrganismos terrestres superficiais e subsuperficiais, enfatizando a coleta de amostras anaeróbias com o mínimo de perturbação. Este protocolo detalha a produção de um meio líquido anaeróbio personalizável, a aquisição ambiental e o crescimento in vitro de microrganismos anaeróbios. O protocolo também abrange componentes críticos de um biorreator anaeróbio usado para simulações ambientais de sedimentos e meios líquidos anaeróbios para culturas ambientalmente adquiridas. Incluímos dados preliminares de sequenciamento de próxima geração de um microbioma mantido ao longo da vida útil de um biorreator onde a cultura ativa se ajustou dinamicamente em resposta a uma fonte de carbono experimental.
A maioria dos microrganismos permanece sem cultura; Isto é suportado pela grande disparidade entre as células observada através da microscopia contrastada pelos poucos microrganismos cultivados com sucesso usando placas de ágar. Staley e Konopka chamaram essa disparidade de “Anomalia da Grande Contagem de Placas”1. A diversidade estimada não contabilizada é suportada por dados metagenômicos e metatranscriptômicos mostrando muitos gêneros novos distribuídos em curvas de abundância de postos de vários ambientesdiferentes 2. Microrganismos que têm sido observados (geralmente por sequenciamento aleatório de uma comunidade microbiana), mas não foram cultivados, têm sido referidos como “matéria escura microbiana”3,4.
Na era da -ômica, a cultura de microrganismos continua sendo imperativa para avaliar completamente os dados genômicos e verificar a função/fenótipo dos genes presentes. O sequenciamento de microrganismos cultivados ainda é a única maneira de obter genomas completos com confiança até que tecnologias como a metagenômica shotgun e genomas montados em metagenomas do ambiente se tornem admissivelmente infalíveis5. Avaliações genômicas juntamente com microrganismos cultivados fornecem fortes inferências para a compreensão da “matéria escura microbiana”. Muitos membros da “matéria escura microbiana” desempenham funções cruciais que afetam a ciclagem de nutrientes e outros elementos e a produção de produtos naturais valiosos, apoiam sistemas ecológicos e executam serviços ecológicos. Do ponto de vista médico, cerca de metade de todos os produtos farmacêuticos atualmente comercializados são produtos e derivados de produtos de bactérias, e suspeita-se que o perfil de espécies não cultivadas revele os antibióticos do futuro. Para ter acesso a essa maioria inculta, uma variedade de metodologias de cultivo deve ser aumentada6. Entre os membros da “matéria escura microbiana”, os microrganismos anaeróbios oligotróficos são amplamente subnotificados e provavelmente possuem vias bioquímicas ecológica e industrialmente valiosas7, tornando-os importantes alvos de cultivo. No entanto, microrganismos oligotróficos anaeróbios são mais difíceis de cultivar do que seus homólogos aeróbios e copiotróficos devido a tempos de incubação mais longos frequentemente exigidos, condições fastidiosas (por exemplo, temperaturas in vitro não padronizadas específicas) e o uso de receitas de meios especializados.
As técnicas atuais de desenvolvimento para cultivar membros da “matéria escura microbiana”, incluindo novos microrganismos anaeróbios oligotróficos, melhoraram muito nossa compreensão e aumentaram a representação desses microrganismos dentro da árvore filogenética. As técnicas atuais que utilizam meios informados para o cultivo de novos microrganismos (isto é, meios derivados do conhecimento do(s) microrganismo(s) de interesse) podem ser separadas em três métodos distintos. O primeiro dos métodos envolve a remoção direta de uma seção discreta do ambiente para transferência para uma câmara de crescimento in vitro que já contém os microrganismos de interesse dentro de uma membrana. A seção discreta (por exemplo, água do mar) atua para fornecer aos microrganismos de interesse o habitat geoquímico que eles usam in situ, enquanto a membrana interrompe o movimento das células através (células de interesse permanecerão dentro; células estranhas que chegaram com a seção discreta permanecerão sem). Ao incluir compostos naturalmente disponíveis para atingir microrganismos em seu habitat natural, tais microrganismos podem ser cultivados8. O segundo método utiliza metatranscriptômica ou genômica para elucidar capacidades metabólicas, fornecendo pistas para parâmetros de cultivo estreitos para um planejamento de meio alvo. Esta abordagem fornece um perfil eco-fisiológico que pode ser usado para direcionar o enriquecimento de tipos específicos de microrganismos fora de um ambiente. As provisões do meio são atendidas para os genes identificados presentes que se presume suportarem o(s) microrganismo(s) alvo(s) para reduzir a diversidade de enriquecimento9,10. Uma ressalva é que a informação genômica não infere diretamente a expressão dos genes, enquanto a informação transcriptômica infere.
O terceiro método engloba mídias ambientalmente informadas e simuladas, distintas do primeiro, que não simula as mídias, mas utiliza diretamente o ambiente como fonte de mídia. Este terceiro método requer o reconhecimento ambiental da geoquímica de um local de campo contendo microrganismos de interesse. Com esse conhecimento, componentes primários e parâmetros físicos são identificados para produzir um meio simulado ambientalmente informado. O meio então recebe uma infusão direta de sedimento ou líquido contendo microrganismos do ambiente para o meio. Este método é particularmente valioso nos casos em que o microbiologista de cultura não tem acesso a quantidades suficientes de ambiente de origem (conforme necessário para o primeiro método) nem a dados metatranscriptômicos ou genômicos apropriados (conforme necessário para o segundo).
O protocolo a seguir é um exemplo do terceiro método; É informado e tem como objetivo simular ambientes de interesse. Três receitas de meios ingênuos visando diferentes culturas de microrganismos anaeróbios adquiridas no campo são apresentadas em paralelo dentro do protocolo. As três culturas representadas são culturas mistas originárias do solo (doravante, cultura mista de solo), culturas mistas originárias de um poço (doravante, cultura mista de poço) e um metanogênio isolado originário de um poço (doravante, metanogênio isolado de poço). As identidades e quantidades compostas nas receitas de mídia compartilhadas aqui são destinadas como um guia inicial; eles são capazes e incentivados a serem personalizados para o ambiente do leitor e microrganismos de interesse.
A seção de produção de meios deste protocolo (seção 1) deve sua estrutura à técnica de Hungate modificada de Miller e Wolin17, que tem sido amplamente utilizada desde sua publicação. A praticidade deste protocolo expandido advém de sua natureza descritiva e de seu pareamento com a aquisição in situ de microrganismos. Frascos de cultura contendo meios ambientalmente informados e simulados foram usados para cultivar com sucesso os seguintes ex-membros da “matéria escura microb…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer a linhagem de informação e orientação que influenciou/evoluiu essas técnicas ao longo dos anos. O Dr. Hamilton-Brehm como ex-aluno de pós-graduação, pós-doc e atual professor tem uma dívida de gratidão com aqueles que dedicaram tempo para ensinar técnicas anaeróbicas: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser e Dr. Brian Hedlund. A Nature Conservancy e a American Rivers apoiaram este trabalho através dos subsídios G21-026-CON-P e AR-CE21GOS373, respectivamente. Quaisquer opiniões, descobertas, conclusões ou recomendações expressas neste artigo são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Nature Conservancy ou da American Rivers. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do SIU Advanced Energy Institute, que agradece o financiamento concedido através do Advanced Energy Resource Board. A NGS foi realizada pela LC Sciences.
General Materials | |||
1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
23 G needle | Fisher Scientifc | ||
500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
Lighter | Lowe's | ||
N2 gas | Airgas | ||
Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
Stirring hot plate | Corning | ||
Trace minerals | ATCC | ||
Vitamins | ATCC | ||
Bioreactor-specific Materials | |||
#10 rubber stopper | Ace Glass | ||
#7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
5/16" – 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
Balloon | Party City | ||
Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
Drill | Lowe's | ||
Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
GL45 open top cap | Ace Glass | ||
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
Ring stand | Fisher Scientific | ||
Ring stand chain clamp | Amazon | ||
Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
Three-way stopcock | Amazon | ||
Two-way stopcock | Amazon | ||
Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
Water bath | Fisher Scientifc | ||
White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
Wire | Lowe's | ||
Zip tie | Lowe's |