Çevresel Olarak Edinilmiş Anaerobik Mikroorganizmaların Kültürlenmesi için Bir Dizi Yerinde Bilgilendirilmiş Simüle Edilmiş Ortam Formatı
Summary
Bu makalenin odak noktası, bir ortamdan elde edilen titiz anaerobik mikroorganizmalar için ortam yapmak için en iyi uygulamaları detaylandırmaktır. Bu yöntemler anaerobik kültürlerin yönetilmesine yardımcı olur ve “mikrobiyal karanlık madde” olarak adlandırılan, kültürlenmemiş mikroorganizmaların büyümesini desteklemek için uygulanabilir.
Abstract
Anaerobik mikroorganizmaların kültüre bağlı araştırmaları metodolojik yeterliliğe dayanır. Bu yöntemler, anaerobik mikroorganizmalar için uygun büyüme koşulları (örneğin, pH ve karbon kaynakları) yaratmalı ve sürdürmeli, aynı zamanda yapay ortamdan ödün vermeden numunelerin ekstrakte edilmesine izin vermelidir. Bu amaçla, yerinde bir ortam tarafından bilgilendirilen ve simüle edilen yöntemler, o ortamdan mikroorganizmaların kültürlenmesinde çok yardımcı olabilir. Burada, minimum bozulma ile anaerobik numune toplamayı vurgulayarak, karasal yüzey ve yüzey altı mikroorganizmaların kültürlenmesi için yerinde bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş bir anaerobik yöntemin ana hatlarını çiziyoruz. Bu protokol, özelleştirilebilir bir anaerobik sıvı ortamın üretimini ve anaerobik mikroorganizmaların çevresel edinimini ve in vitro büyümesini detaylandırır. Protokol ayrıca, çevresel olarak edinilen kültürler için tortu ve anaerobik sıvı ortamın çevresel simülasyonları için kullanılan bir anaerobik biyoreaktörün kritik bileşenlerini de kapsar. Aktif kültürün deneysel bir karbon kaynağına yanıt olarak dinamik olarak ayarlandığı bir biyoreaktörün ömrü boyunca korunan bir mikrobiyomdan elde edilen ön Yeni Nesil Dizileme verilerini dahil ettik.
Introduction
Çoğu mikroorganizma kültürlenmemiş olarak kalır; Bu, agar plakaları kullanılarak başarılı bir şekilde kültürlenen birkaç mikroorganizmanın aksine, mikroskopi ile gözlemlenen hücreler arasındaki büyük eşitsizlik ile desteklenir. Staley ve Konopka bu eşitsizliği “Büyük Plaka Sayısı Anomalisi” olarak adlandırdılar1. Tahmini hesaplanmamış çeşitlilik, birkaç farklı ortamdan sıra bolluk eğrilerinde dağılmış birçok yeni cinsi gösteren metagenomik ve metatranskriptomik verilerle desteklenmektedir2. Gözlemlenen mikroorganizmalar (genellikle bir mikrobiyal topluluğun rastgele av tüfeği dizilimi ile) ancak kültürlenmemiş “mikrobiyal karanlık madde” olarak adlandırılmıştır3,4.
-Omik çağında, genomik verileri tam olarak değerlendirmek ve mevcut genlerin işlevini/fenotipini doğrulamak için mikroorganizmaların kültürlenmesi zorunludur. Kültürlenmiş mikroorganizmaların dizilenmesi, av tüfeği metagenomikleri ve çevreden metagenomla birleştirilmiş genomlar gibi teknolojiler kabul edilebilir bir şekilde yanılmaz hale gelene kadar tam genomları güvenle elde etmenin tek yoludur5. Kültürlenmiş mikroorganizmalarla birleştirilmiş genomik değerlendirmeler, “mikrobiyal karanlık maddeyi” anlamak için güçlü çıkarımlar sağlar. “Mikrobiyal karanlık maddenin” birçok üyesi, besinlerin ve diğer elementlerin döngüsünü ve değerli doğal ürünlerin üretimini etkileyen, ekolojik sistemleri destekleyen ve ekolojik hizmetleri yerine getiren önemli işlevleri yerine getirir. Tıbbi açıdan bakıldığında, şu anda pazarlanan tüm ilaçların yaklaşık yarısı, bakterilerden elde edilen ürünlerin ürünleri ve türevleridir ve kültürlenmemiş türlerin profillenmesinin geleceğin antibiyotiklerini ortaya çıkardığından şüphelenilmektedir. Bu kültürsüz çoğunluğa erişmek için, çeşitli kültür metodolojileri artırılmalıdır6. “Mikrobiyal karanlık madde” üyeleri arasında, anaerobik oligotrofik mikroorganizmalar büyük ölçüde rapor edilmemiştir ve muhtemelen ekolojik ve endüstriyel olarak değerli biyokimyasal yollara7 sahiptir, bu da onları kültürlemenin önemli hedefleri haline getirir. Bununla birlikte, anaerobik oligotrofik mikroorganizmaların kültürlenmesi, genellikle gerekli olan daha uzun inkübasyon süreleri, titiz koşullar (örneğin, belirli standart dışı in vitro sıcaklıklar) ve özel ortam tariflerinin kullanımı nedeniyle aerobik ve kopiotrofik muadillerine göre daha zordur.
Yeni anaerobik oligotrofik mikroorganizmalar da dahil olmak üzere “mikrobiyal karanlık madde” üyelerini kültürlemek için mevcut gelişen teknikler, anlayışımızı büyük ölçüde geliştirdi ve bu mikroorganizmaların filogenetik ağaç içindeki temsilini artırdı. Yeni mikroorganizmaların kültürlenmesi için bilgilendirilmiş ortam kullanan mevcut teknikler (yani, ilgilenilen mikroorganizma/organizmaların bilgisi kullanılarak türetilen ortam) üç farklı yönteme ayrılabilir. Yöntemlerden ilki, bir zar içinde ilgilenilen mikroorganizmaları zaten içeren bir in vitro büyüme odasına transfer için ortamın ayrı bir bölümünün doğrudan çıkarılmasını gerektirir. Ayrık bölüm (örneğin, deniz suyu), ilgilenilen mikroorganizmalara yerinde kullandıkları jeokimyasal habitatı sağlamak için hareket ederken, zar hücrelerin hareketini durdurur (ilgilenilen hücreler içeride kalacaktır; ayrık bölümle gelen yabancı hücreler dışarıda kalacaktır). Mikroorganizmaları doğal ortamlarında hedeflemek için doğal olarak bulunan bileşikleri dahil ederek, bu tür mikroorganizmalar kültürlenebilir8. İkinci yöntem, metabolik yetenekleri aydınlatmak için metatranskriptomik veya genomik kullanır ve hedeflenen bir ortam tasarımı için dar kültür parametrelerine ipuçları sağlar. Bu yaklaşım, belirli mikroorganizma türlerinin bir ortamdan zenginleştirilmesini hedeflemek için kullanılabilecek eko-fizyolojik bir profil sağlar. Ortamın hükümleri, zenginleştirme çeşitliliğini azaltmak için hedeflenen mikroorganizma(lar)ı desteklediği varsayılan mevcut tanımlanmış genlere yöneliktir,9,10. Bir uyarı, genomik bilginin genlerin ekspresyonunu doğrudan anlamadığı, transkriptomik bilginin ise çıkardığıdır.
Üçüncü yöntem, medyayı simüle etmeyen, bunun yerine çevreyi doğrudan bir medya kaynağı olarak kullanan birinci yöntemden farklı olarak, çevresel olarak bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş medyayı kapsar. Bu üçüncü yöntem, ilgilenilen mikroorganizmaları içeren bir saha sahasının jeokimyasının çevresel keşfini gerektirir. Bu bilgiyle, çevresel olarak bilgilendirilmiş simüle edilmiş bir ortam üretmek için birincil bileşenler ve fiziksel parametreler tanımlanır. Ortam daha sonra ortamdan ortama mikroorganizma içeren tortu veya sıvının doğrudan infüzyonunu alır. Bu yöntem, kültür mikrobiyoloğunun yeterli miktarda kaynak ortama (ilk yöntem için gerektiği gibi) veya uygun metatranskriptomik veya genomik verilere (ikincisi için gerektiği gibi) erişiminin olmadığı durumlarda özellikle değerlidir.
Aşağıdaki protokol üçüncü yönteme bir örnektir; İlgilenilen ortamlar tarafından bilgilendirilir ve simüle etmeyi amaçlar. Protokol kapsamında, sahada elde edilen farklı anaerobik mikroorganizma kültürlerini hedef alan üç naif besiyeri reçetesi paralel olarak sunulmaktadır. Temsil edilen üç kültür, topraktan kaynaklanan karışık kültürler (bundan sonra toprak karışık kültür olarak anılacaktır), bir sondaj deliğinden kaynaklanan karışık kültürler (bundan sonra sondaj deliği karışık kültürü) ve bir sondaj deliğinden kaynaklanan izole edilmiş bir metanojendir (bundan sonra, sondaj deliği izole metanojen). Burada paylaşılan medya tariflerinde yer alan bileşik kimlikler ve miktarlar bir başlangıç rehberi niteliğindedir; Okuyucunun çevresine ve ilgilendiği mikroorganizmalara göre özelleştirilebilir ve teşvik edilirler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün orta üretim bölümü (bölüm 1) yapısını, yayınlanmasından bu yana yaygın olarak kullanılan Miller ve Wolin17’nin değiştirilmiş Hungate tekniğine borçludur. Bu genişletilmiş protokolün pratikliği, tanımlayıcı doğasından ve mikroorganizmaların yerinde edinilmesiyle eşleşmesinden kaynaklanmaktadır. Çevresel olarak bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş ortam içeren kültür şişeleri, “mikrobiyal karanlık maddenin” yerinde edinilmiş eski üyele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, yıllar içinde bu teknikleri etkileyen/geliştiren bilgi ve mentorluk soyunu kabul etmek istemektedir. Eski bir yüksek lisans öğrencisi, doktora sonrası ve şu anki profesör olarak Dr. Hamilton-Brehm, anaerobik teknikleri öğretmek için zaman ayıranlara şükran borçludur: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser ve Dr. Brian Hedlund. Nature Conservancy ve American Rivers, bu çalışmayı sırasıyla G21-026-CON-P ve AR-CE21GOS373 hibeleriyle destekledi. Bu yazıda ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya tavsiye yazarlara aittir ve Nature Conservancy veya American Rivers’ın görüşlerini yansıtmayabilir. Bu çalışma, Gelişmiş Enerji Kaynakları Kurulu aracılığıyla verilen finansmanı minnetle kabul eden SIU Gelişmiş Enerji Enstitüsü’nden bir hibe ile desteklenmiştir. NGS, LC Sciences tarafından gerçekleştirilmiştir.
Materials
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" – 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the’omics’ age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
- . Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013)
- . Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018)
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).
