Un conjunto de formatos de medios simulados informados in situ para el cultivo de microorganismos anaeróbicos adquiridos en el medio ambiente
Summary
El objetivo de este artículo es detallar las mejores prácticas para la fabricación de medios para microorganismos anaeróbicos exigentes adquiridos de un medio ambiente. Estos métodos ayudan a manejar los cultivos anaeróbicos y se pueden aplicar para apoyar el crecimiento de microorganismos no cultivados elusivos, la “materia oscura microbiana”.
Abstract
La investigación dependiente del cultivo de microorganismos anaerobios se basa en la competencia metodológica. Estos métodos deben crear y mantener condiciones de crecimiento adecuadas (por ejemplo, pH y fuentes de carbono) para los microorganismos anaeróbicos, al tiempo que permiten extraer muestras sin comprometer el entorno artificial. Con este fin, los métodos que se basan en un entorno in situ y lo simulan pueden ser de gran ayuda en el cultivo de microorganismos de ese entorno. Aquí, describimos un método anaeróbico in situ informado y simulado para el cultivo de microorganismos terrestres de superficie y subsuelo, enfatizando la recolección anaeróbica de muestras con una perturbación mínima. Este protocolo detalla la producción de un medio líquido anaeróbico personalizable y la adquisición ambiental y el crecimiento in vitro de microorganismos anaeróbicos. El protocolo también cubre los componentes críticos de un biorreactor anaeróbico utilizado para simulaciones ambientales de sedimentos y medios líquidos anaeróbicos para cultivos adquiridos ambientalmente. Hemos incluido datos preliminares de secuenciación de nueva generación de un microbioma mantenido durante la vida útil de un biorreactor en el que el cultivo activo se ajustó dinámicamente en respuesta a una fuente de carbono experimental.
Introduction
La mayoría de los microorganismos permanecen sin cultivar; Esto se ve respaldado por la gran disparidad entre las células observadas a través de la microscopía contrastada con los pocos microorganismos cultivados con éxito utilizando placas de agar. Staley y Konopka llamaron a esta disparidad la “Gran Anomalía del Conteo de Placas”1. La diversidad estimada no contabilizada está respaldada por datos metagenómicos y metatranscriptómicos que muestran muchos géneros nuevos distribuidos en curvas de abundancia de rangos de varios ambientes diferentes2. Los microorganismos que se han observado (generalmente mediante secuenciación aleatoria de una comunidad microbiana) pero que no han sido cultivados se han denominado “materia oscura microbiana”3,4.
En la era de las -ómicas, el cultivo de microorganismos sigue siendo imperativo para evaluar completamente los datos genómicos y verificar la función/fenotipo de los genes presentes. La secuenciación de microorganismos cultivados sigue siendo la única forma de obtener genomas completos con confianza hasta que tecnologías como la metagenómica de escopeta y los genomas ensamblados con metagenomas del medio ambiente se vuelvan admisiblementeinfalibles. Las evaluaciones genómicas junto con los microorganismos cultivados proporcionan fuertes inferencias para comprender la “materia oscura microbiana”. Muchos miembros de la “materia oscura microbiana” realizan funciones cruciales que afectan el ciclo de nutrientes y otros elementos y la producción de productos naturales valiosos, apoyan los sistemas ecológicos y realizan servicios ecológicos. Desde el punto de vista médico, alrededor de la mitad de todos los productos farmacéuticos comercializados actualmente son productos y derivados de productos de bacterias, y se sospecha que el perfil de especies no cultivadas revelará los antibióticos del futuro. Para acceder a esta mayoría inculta, se debe aumentar una variedad de metodologías de cultivo6. Entre los miembros de la “materia oscura microbiana”, los microorganismos oligotróficos anaeróbicos están en gran medida subestimados y probablemente contienen vías bioquímicas ecológica e industrialmentevaliosas, lo que los convierte en objetivos importantes de cultivo. Sin embargo, los microorganismos oligotróficos anaeróbicos son más difíciles de cultivar que sus homólogos aeróbicos y copiotróficos debido a los tiempos de incubación más largos que a menudo se requieren, las condiciones exigentes (por ejemplo, temperaturas in vitro particulares no estándar) y el uso de recetas de medios especializados.
Las técnicas actuales en desarrollo para cultivar miembros de la “materia oscura microbiana”, incluidos nuevos microorganismos oligotróficos anaeróbicos, han mejorado en gran medida nuestra comprensión y han aumentado la representación de estos microorganismos dentro del árbol filogenético. Las técnicas actuales que utilizan medios informados para el cultivo de microorganismos novedosos (es decir, medios que se derivan utilizando el conocimiento de los microorganismos de interés) pueden dividirse en tres métodos distintos. El primero de los métodos consiste en la eliminación directa de una sección discreta del medio ambiente para transferirla a una cámara de crecimiento in vitro que ya contiene los microorganismos de interés dentro de una membrana. La sección discreta (por ejemplo, el agua de mar) actúa para proporcionar a los microorganismos de interés el hábitat geoquímico que utilizan in situ, mientras que la membrana detiene el movimiento de las células a través de él (las células de interés permanecerán dentro; las células extrañas que llegaron con la sección discreta permanecerán fuera). Al incluir compuestos naturalmente disponibles para atacar microorganismos en su hábitat natural, dichos microorganismos pueden cultivarse8. El segundo método utiliza la metatranscriptómica o genómica para dilucidar las capacidades metabólicas, proporcionando pistas sobre parámetros de cultivo estrechos para un diseño de medio dirigido. Este enfoque proporciona un perfil ecofisiológico que se puede utilizar para orientar el enriquecimiento de tipos específicos de microorganismos fuera de un medio ambiente. Las provisiones del medio se atienden a los genes identificados presentes que se presume que apoyan a los microorganismos objetivo para reducir la diversidad de enriquecimiento,9,10. Una advertencia es que la información genómica no infiere directamente la expresión de los genes, mientras que la información transcriptómica sí lo hace.
El tercer método engloba los medios de comunicación informados sobre el medio ambiente y los medios de comunicación, a diferencia del primer método, que no simula los medios de comunicación, sino que utiliza el medio ambiente directamente como fuente de medios. Este tercer método requiere el reconocimiento ambiental de la geoquímica de un sitio de campo que contiene microorganismos de interés. Con este conocimiento, se identifican los componentes primarios y los parámetros físicos para producir un medio simulado ambientalmente informado. Luego, el medio recibe una infusión directa de sedimento o líquido que contiene microorganismos del medio ambiente en el medio. Este método es de particular valor en los casos en que el microbiólogo de cultivo no tiene acceso a cantidades suficientes de ambiente de origen (como se necesita para el primer método) ni a datos metatranscriptómicos o genómicos apropiados (como se necesita para el segundo).
El siguiente protocolo es un ejemplo del tercer método; Se basa en entornos de interés y tiene como objetivo simularlos. En el protocolo se presentan en paralelo tres recetas ingenuas dirigidas a diferentes cultivos anaeróbicos de microorganismos adquiridos en el campo. Los tres cultivos representados son los cultivos mixtos que se originan en el suelo (en adelante, el cultivo mixto del suelo), los cultivos mixtos que se originan en el interior de un pozo (en adelante, el cultivo mixto del pozo) y un metanógeno aislado que se origina en el interior de un pozo (en adelante, metanógeno aislado del pozo). Las identidades compuestas y las cantidades en las recetas de los medios de comunicación compartidas aquí pretenden ser una guía inicial; Son capaces y se les anima a personalizarse según el entorno del lector y los microorganismos de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La sección de producción media de este protocolo (sección 1) debe su estructura a la técnica de Hungate modificada de Miller y Wolin17, que ha sido ampliamente utilizada desde su publicación. La practicidad de este protocolo ampliado proviene de su naturaleza descriptiva y de su emparejamiento con la adquisición in situ de microorganismos. Se han utilizado frascos de cultivo que contienen medios simulados e informados sobre el medio ambiente para cultivar con éxito los siguientes a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A los autores les gustaría reconocer el linaje de información y tutoría que ha influido/evolucionado estas técnicas a lo largo de los años. El Dr. Hamilton-Brehm, como ex estudiante de posgrado, postdoctorado y profesor actual, tiene una deuda de gratitud con aquellos que se tomaron el tiempo para enseñar técnicas anaeróbicas: el Dr. Mike Adams, el Dr. Gerti Schut, el Dr. Jim Elkins, el Dr. Mircea Podar, el Dr. Duane Moser y el Dr. Brian Hedlund. The Nature Conservancy y American Rivers apoyaron este trabajo a través de las subvenciones G21-026-CON-P y AR-CE21GOS373, respectivamente. Las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este documento pertenecen a los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de The Nature Conservancy o American Rivers. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto de Energía Avanzada de SIU, que agradece la financiación otorgada a través de la Junta de Recursos Energéticos Avanzados. La NGS fue realizada por LC Sciences.
Materials
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" – 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
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