קבוצה של פורמטים מדומים מדומים באתרם לטיפוח מיקרואורגניזמים אנאירוביים שנרכשו בסביבה
Summary
המוקד של מאמר זה הוא לפרט שיטות עבודה מומלצות להכנת מדיה עבור מיקרואורגניזמים אנאירוביים מהירים שנרכשו מסביבה. שיטות אלה מסייעות בניהול תרביות אנאירוביות וניתן ליישם אותן כדי לתמוך בצמיחה של מיקרואורגניזמים חמקמקים ולא מתורבתים, “החומר האפל המיקרוביאלי”.
Abstract
מחקר תלוי תרבות של מיקרואורגניזמים אנאירוביים נשען על יכולת מתודולוגית. שיטות אלה חייבות ליצור ולתחזק תנאי גידול מתאימים (למשל, pH ומקורות פחמן) עבור מיקרואורגניזמים אנאירוביים, תוך מתן אפשרות להפקת דגימות מבלי לפגוע בסביבה המלאכותית. לשם כך, שיטות המבוססות על סביבה באתרה ומדמות אותה יכולות לסייע רבות בגידול מיקרואורגניזמים מסביבה זו. כאן, אנו מתארים שיטה אנאירובית מושכלת ומדומה באתרה לגידול מיקרואורגניזמים יבשתיים ותת-קרקעיים, תוך שימת דגש על איסוף דגימות אנאירוביות עם הפרעה מינימלית. פרוטוקול זה מפרט את הייצור של תווך נוזלי אנאירובי הניתן להתאמה אישית, ואת הרכישה הסביבתית והצמיחה במבחנה של מיקרואורגניזמים אנאירוביים. הפרוטוקול מכסה גם רכיבים קריטיים של ביוריאקטור אנאירובי המשמש להדמיות סביבתיות של משקעים ומדיה נוזלית אנאירובית עבור תרבויות שנרכשו סביבתיים. כללנו נתוני ריצוף ראשוניים מהדור הבא ממיקרוביום מתוחזק לאורך תוחלת החיים של ביוריאקטור, שבו התרבית הפעילה התאימה את עצמה באופן דינמי בתגובה למקור פחמן ניסיוני.
Introduction
רוב המיקרואורגניזמים נותרים בלתי מתורבתים; זה נתמך על ידי הפער הגדול בין התאים שנצפו באמצעות מיקרוסקופיה, בניגוד למיקרואורגניזמים המעטים שגודלו בהצלחה באמצעות לוחות אגר. סטיילי וקונופקה כינו פער זה “אנומליה של ספירת הלוחות הגדולה”1. המגוון המשוער שאינו מוסבר נתמך על ידי נתונים מטאגנומיים ומטה-טרנסקריפטומיים המראים סוגים חדשים רבים המופצים בעקומות שפע דרגות מסביבות שונות2. מיקרואורגניזמים שנצפו (בדרך כלל על ידי ריצוף אקראי של רובה ציד של קהילה מיקרוביאלית) אך לא תורבתו כונו “חומר אפל מיקרוביאלי”3,4.
בעידן האומיקס, גידול מיקרואורגניזמים נותר הכרחי כדי להעריך באופן מלא נתונים גנומיים ולאמת את הפונקציה/פנוטיפ של הגנים הנוכחיים. ריצוף מיקרואורגניזמים בתרבית הוא עדיין הדרך היחידה להשיג בביטחון גנומים שלמים עד שטכנולוגיות כגון מטגנומיקה של רובה ציד וגנומים שהורכבו מטא-גנום מהסביבה יהפכו לבלתי קבילותלטעות 5. הערכות גנומיות יחד עם מיקרואורגניזמים בתרבית מספקות מסקנות חזקות להבנת “חומר אפל מיקרוביאלי”. חברים רבים ב”חומר האפל המיקרוביאלי” מבצעים תפקידים חיוניים המשפיעים על מחזור חומרי מזון ואלמנטים אחרים ועל ייצור מוצרים טבעיים יקרי ערך, תומכים במערכות אקולוגיות ומבצעים שירותים אקולוגיים. מבחינה רפואית, כמחצית מכלל התרופות המשווקות כיום הן מוצרים ונגזרות של מוצרים מחיידקים, ופרופיל זנים לא מתורבתים חשוד כחושף את האנטיביוטיקות של העתיד. כדי לקבל גישה לרוב חסר תרבות זה, יש להגדיל מגוון של מתודולוגיות טיפוח6. בקרב חברי “החומר האפל המיקרוביאלי”, מיקרואורגניזמים אוליגוטרופיים אנאירוביים אינם מדווחים במידה רבה, וסביר להניח שהם מחזיקים במסלולים ביוכימיים בעלי ערך אקולוגי ותעשייתי7, מה שהופך אותם למטרות חשובות של תרבית. עם זאת, מיקרואורגניזמים אוליגוטרופיים אנאירוביים קשים יותר לתרבית מאשר עמיתיהם האירוביים והקופיוטרופיים בשל זמני דגירה ארוכים יותר הנדרשים לעתים קרובות, תנאים קפדניים (למשל, טמפרטורות מבחנה לא סטנדרטיות מסוימות), ושימוש במתכוני מדיה מיוחדים.
הטכניקות המתפתחות כיום לתרבית חברי “החומר האפל המיקרוביאלי”, כולל מיקרואורגניזמים אוליגוטרופיים אנאירוביים חדשניים, שיפרו מאוד את הבנתנו והגדילו את הייצוג של מיקרואורגניזמים אלה בתוך העץ הפילוגנטי. ניתן להפריד את הטכניקות הנוכחיות המשתמשות במדיה מושכלת לטיפוח מיקרואורגניזמים חדשים (כלומר, מדיה הנגזרת באמצעות ידע על המיקרואורגניזמים/ים המעניינים) לשלוש שיטות נפרדות. הראשונה מבין השיטות כרוכה בהסרה ישירה של חלק נפרד מהסביבה לצורך העברה לתא גדילה במבחנה שכבר מכיל את המיקרואורגניזמים המעניינים בתוך הממברנה. החלק הבדיד (למשל, מי ים) פועל כדי לספק למיקרואורגניזמים המעניינים את בית הגידול הגיאוכימי שבו הם משתמשים באתרם, בעוד שהממברנה עוצרת את תנועת התאים על פני (תאים בעלי עניין יישארו בפנים; תאים חיצוניים שהגיעו עם החלק הבדיד יישארו בלי). על ידי הכללת תרכובות הזמינות באופן טבעי למיקרואורגניזמים בסביבתם הטבעית, מיקרואורגניזמים כאלה יכולים להיות מתורבתים8. השיטה השנייה משתמשת במטא-טרנסקריפטומיקה או גנומיקה כדי להבהיר יכולות מטבוליות, ומספקת רמזים לפרמטרים צרים של תרבית לתכנון מדיום ממוקד. גישה זו מספקת פרופיל אקו-פיזיולוגי שניתן להשתמש בו כדי להתמקד בהעשרה של סוגים ספציפיים של מיקרואורגניזמים מחוץ לסביבה. הוראות המדיום מותאמות לגנים המזוהים הנוכחיים הנחזים לתמוך במיקרואורגניזמים הממוקדים כדי להפחית את מגוון ההעשרה,9,10. אזהרה אחת היא שמידע גנומי אינו מסיק ישירות את ביטוי הגנים, בעוד שמידע שעתוק כן.
השיטה השלישית כוללת מדיה מודעת סביבתית ומדומה, להבדיל מהשיטה הראשונה, שאינה מדמה את המדיה אלא משתמשת בסביבה ישירות כמקור לתקשורת. שיטה שלישית זו דורשת סיור סביבתי של הגיאוכימיה של אתר שדה המכיל מיקרואורגניזמים בעלי עניין. בעזרת ידע זה, רכיבים ראשוניים ופרמטרים פיזיים מזוהים כדי לייצר מדיום מדומה מודע לסביבה. לאחר מכן התווך מקבל עירוי ישיר של משקעים או נוזלים המכילים מיקרואורגניזמים מהסביבה לתוך המדיום. שיטה זו היא בעלת ערך מיוחד במקרים בהם למיקרוביולוג המטפח אין גישה לכמויות מספיקות של סביבת מקור (לפי הצורך בשיטה הראשונה) וגם לא לנתונים מטא-תעתוקים או גנומיים מתאימים (לפי הצורך בשיטה השנייה).
הפרוטוקול הבא הוא דוגמה לשיטה השלישית; הוא מושכל על ידי ומטרתו לדמות סביבות עניין. שלושה מתכוני מדיה נאיביים המכוונים לתרביות מיקרואורגניזמים אנאירוביות שונות שנרכשו בתחום מוצגים במקביל בתוך הפרוטוקול. שלוש התרבויות המיוצגות הן תרבויות מעורבות שמקורן באדמה (להלן: תרבית מעורבת קרקע), תרבויות מעורבות שמקורן מתוך קידוח (להלן: תרבית מעורבת בקידוח), ומתאנוגן מבודד שמקורו בתוך קידוח (להלן: מתאנוגן מבודד מקידוח). הזהויות והכמויות המורכבות במתכוני המדיה המשותפים כאן נועדו לשמש מדריך מתחיל; הם מסוגלים ומעודדים להיות מותאמים אישית לסביבה של הקורא ומיקרואורגניזמים של עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרק הייצור הבינוני של פרוטוקול זה (סעיף 1) חב את מבנהו לטכניקת ההונגט השונה של מילר וולין17, שהייתה בשימוש נרחב מאז פרסומה. המעשיות של פרוטוקול מורחב זה נובעת מאופיו התיאורי ומהזיווג שלו עם רכישה באתרו של מיקרואורגניזמים. בקבוקי תרבית המכילים מדיה מדומה ומודעת לסביבה שימש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר בשושלת המידע וההדרכה שהשפיעו / פיתחו טכניקות אלה לאורך השנים. ד”ר המילטון-ברהם כסטודנטית לתואר שני, פוסט-דוקטורנטית ופרופסור בהווה חבה חוב של הכרת תודה לאלה שהקדישו מזמנם ללמד טכניקות אנאירוביות: ד”ר מייק אדמס, ד”ר גרטי שוט, ד”ר ג’ים אלקינס, ד”ר מירצ’ה פודאר, ד”ר דואן מוזר וד”ר בריאן הדלונד. Nature Conservancy ו-American Rivers תמכו בעבודה זו באמצעות מענקים G21-026-CON-P ו-AR-CE21GOS373, בהתאמה. כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את הדעות של שמורת הטבע או של נהרות אמריקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון לאנרגיה מתקדמת של SIU, אשר מכיר בהכרת תודה במימון המוענק באמצעות מועצת משאבי האנרגיה המתקדמת. NGS בוצע על ידי LC Sciences.
Materials
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" – 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the’omics’ age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
- . Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013)
- . Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018)
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).
