Summary

Een set van in situ geïnformeerde gesimuleerde mediumformaten voor het kweken van milieuvriendelijke anaërobe micro-organismen

Published: January 12, 2024
doi:

Summary

De focus van dit artikel ligt op het beschrijven van best practices voor het maken van media voor veeleisende anaërobe micro-organismen die uit een omgeving zijn verkregen. Deze methoden helpen bij het beheren van anaërobe culturen en kunnen worden toegepast om de groei van ongrijpbare niet-gekweekte micro-organismen, de ‘microbiële donkere materie’, te ondersteunen.

Abstract

Cultuurafhankelijk onderzoek van anaërobe micro-organismen berust op methodologische competentie. Deze methoden moeten geschikte groeiomstandigheden (bijv. pH en koolstofbronnen) voor anaërobe micro-organismen creëren en handhaven, terwijl ook monsters kunnen worden geëxtraheerd zonder de kunstmatige omgeving in gevaar te brengen. Daartoe kunnen methoden die zijn gebaseerd op en een in situ-omgeving simuleren, een grote hulp zijn bij het kweken van micro-organismen uit die omgeving. Hier schetsen we een in situ geïnformeerde en gesimuleerde anaërobe methode voor het kweken van terrestrische oppervlakte- en ondergrondse micro-organismen, met de nadruk op anaërobe monsterverzameling met minimale verstoring. Dit protocol beschrijft de productie van een aanpasbaar anaëroob vloeibaar medium en de omgevingsverwerving en in vitro groei van anaërobe micro-organismen. Het protocol heeft ook betrekking op kritieke componenten van een anaërobe bioreactor die wordt gebruikt voor omgevingssimulaties van sediment en anaërobe vloeibare media voor milieuvriendelijke culturen. We hebben voorlopige Next Generation Sequencing-gegevens opgenomen van een gehandhaafd microbioom gedurende de levensduur van een bioreactor waarbij de actieve cultuur zich dynamisch aanpaste als reactie op een experimentele koolstofbron.

Introduction

De meeste micro-organismen blijven ongekweekt; Dit wordt ondersteund door de grote ongelijkheid tussen cellen die door microscopie wordt waargenomen, in tegenstelling tot de weinige micro-organismen die met succes zijn gekweekt met behulp van agarplaten. Staley en Konopka noemden deze ongelijkheid de “Great Plate Count Anomaly”1. De geschatte niet-verantwoorde diversiteit wordt ondersteund door metagenomische en metatranscriptomische gegevens die veel nieuwe geslachten laten zien, verdeeld in rangovervloedscurven uit verschillende omgevingen2. Micro-organismen die zijn waargenomen (meestal door willekeurige shotgun-sequencing van een microbiële gemeenschap) maar niet zijn gekweekt, worden “microbiële donkere materie” genoemd3,4.

In het tijdperk van -omics blijft het kweken van micro-organismen noodzakelijk om genomische gegevens volledig te evalueren en de functie/het fenotype van de aanwezige genen te verifiëren. Het sequencen van gekweekte micro-organismen is nog steeds de enige manier om met vertrouwen volledige genomen te verkrijgen totdat technologieën zoals shotgun-metagenomica en metagenoom-geassembleerde genomen uit de omgeving toelaatbaar onfeilbaar worden5. Genomische evaluaties in combinatie met gekweekte micro-organismen bieden sterke gevolgtrekkingen voor het begrijpen van ‘microbiële donkere materie’. Veel leden van de “microbiële donkere materie” vervullen cruciale functies die van invloed zijn op de kringloop van voedingsstoffen en andere elementen en de productie van waardevolle natuurlijke producten, ecologische systemen ondersteunen en ecologische diensten verlenen. Vanuit medisch oogpunt zijn ongeveer de helft van alle momenteel op de markt gebrachte geneesmiddelen producten en derivaten van producten van bacteriën, en het profileren van niet-gekweekte soorten wordt vermoed de antibiotica van de toekomst te onthullen. Om toegang te krijgen tot deze onbeschaafde meerderheid, moet een verscheidenheid aan teeltmethoden worden uitgebreid6. Onder de leden van de “microbiële donkere materie” worden anaërobe oligotrofe micro-organismen grotendeels ondergerapporteerd en bevatten ze waarschijnlijk ecologisch en industrieel waardevolle biochemische routes7, waardoor ze belangrijke doelen van kweek zijn. Anaërobe oligotrofe micro-organismen zijn echter moeilijker te kweken dan hun aërobe en copiotage tegenhangers vanwege de vaak vereiste langere incubatietijden, veeleisende omstandigheden (bijv. bepaalde niet-standaard in-vitrotemperaturen ) en het gebruik van gespecialiseerde mediarecepten.

De huidige ontwikkelingstechnieken om leden van de “microbiële donkere materie” te kweken, waaronder nieuwe anaërobe oligotrofe micro-organismen, hebben ons begrip aanzienlijk verbeterd en de vertegenwoordiging van deze micro-organismen in de fylogenetische boom vergroot. De huidige technieken die gebruik maken van geïnformeerde media voor het kweken van nieuwe micro-organismen (d.w.z. media die zijn afgeleid met behulp van kennis van het (de) micro-organisme(n) van belang) kunnen worden onderverdeeld in drie verschillende methoden. De eerste van de methoden omvat de directe verwijdering van een discreet deel van de omgeving voor overdracht naar een in-vitrogroeikamer die al de micro-organismen van belang in een membraan bevat. Het discrete gedeelte (bijv. zeewater) fungeert om de micro-organismen van belang te voorzien van de geochemische habitat die ze in situ gebruiken, terwijl het membraan de beweging van cellen over de streep stopt (cellen van belang blijven binnen; vreemde cellen die met het discrete gedeelte zijn aangekomen, blijven zonder). Door verbindingen op te nemen die van nature beschikbaar zijn voor micro-organismen in hun natuurlijke habitat, kunnen dergelijke micro-organismen worden gekweekt8. De tweede methode maakt gebruik van metatranscriptomics of genomica om metabolische mogelijkheden op te helderen, waardoor aanwijzingen worden gegeven voor smalle kweekparameters voor een gericht mediumontwerp. Deze aanpak levert een ecofysiologisch profiel op dat kan worden gebruikt om de verrijking van specifieke soorten micro-organismen uit een omgeving te richten. De voorzieningen van het medium zijn afgestemd op de geïdentificeerde aanwezige genen waarvan wordt aangenomen dat ze het (de) beoogde micro-organisme(n) ondersteunen om de verrijkingsdiversiteit te verminderen,9,10. Een voorbehoud is dat genomische informatie niet direct de expressie van genen afleidt, terwijl transcriptomische informatie dat wel doet.

De derde methode omvat milieuvriendelijke en gesimuleerde media, die verschilt van de eerste methode, waarbij de media niet worden gesimuleerd, maar de omgeving rechtstreeks als mediabron wordt gebruikt. Deze derde methode vereist milieuverkenning van de geochemie van een veldlocatie die interessante micro-organismen bevat. Met deze kennis worden primaire componenten en fysische parameters geïdentificeerd om een milieuvriendelijk gesimuleerd medium te produceren. Het medium ontvangt vervolgens een directe infusie van micro-organisme-bevattend sediment of vloeistof uit de omgeving in het medium. Deze methode is met name van belang in gevallen waarin de kweekmicrobioloog geen toegang heeft tot voldoende hoeveelheden bronmilieu (zoals nodig voor de eerste methode) noch tot geschikte metatranscriptomische of genomische gegevens (zoals nodig voor de tweede).

Het volgende protocol is een voorbeeld van de derde methode; Het is geïnformeerd door en heeft tot doel interessante omgevingen te simuleren. Drie naïeve mediarecepten die gericht zijn op verschillende anaërobe micro-organismeculturen die in het veld zijn verworven, worden parallel gepresenteerd in het protocol. De drie vertegenwoordigde culturen zijn gemengde culturen afkomstig van de bodem (hierna “gemengde bodemcultuur”), gemengde culturen afkomstig van een boorgat (hierna “gemengde cultuur van boorgaten” genoemd) en een geïsoleerd methanogeen afkomstig van een boorgat (hierna “boorgatgeïsoleerd methaanogeen”). De samengestelde identiteiten en hoeveelheden in de mediarecepten die hier worden gedeeld, zijn bedoeld als een begingids; Ze kunnen en worden aangemoedigd om te worden aangepast aan de omgeving van de lezer en de micro-organismen die van belang zijn.

Protocol

1. Productie van aanpasbaar anaëroob vloeibaar medium Medium voor kweekflessen (productie van 500 ml)Meet verbindingen af en voeg ze toe aan een fles van 1 liter en pas de pH aan met behulp van de kolom in tabel 1 die overeenkomt met de interessecultuur van de lezer (de hoeveelheden in tabel 1 zijn geregistreerd voor de productie van 1.000 ml, dienovereenkomstig aanpassen). Meng verbindingen tot homogeniteit door de fles rond te draaien. Ver…

Representative Results

Hier tonen we de resultaten van een bioreactorstudie met behulp van een bereidingsmethode voor boorgatmengcultuurmedium en een methode voor het opzetten van een bioreactor zoals hierin beschreven. Het boorgat mengcultuurmedium werd gemodificeerd om als koolstofbron een suspensie van maïskolven te bevatten die zijn verwerkt door middel van oxidatieve hydrothermale oplossing (OHD)13,14. Gemodificeerd boorgat mengcultuurmedium werd gedurende 44 dagen in de bioreact…

Discussion

Het medium productie gedeelte van dit protocol (sectie 1) dankt zijn structuur aan de gemodificeerde Hungate-techniek van Miller en Wolin17, die sinds de publicatie ervan op grote schaal is gebruikt. De bruikbaarheid van dit uitgebreide protocol komt voort uit het beschrijvende karakter en de combinatie met de in situ verwerving van micro-organismen. Kweekflessen met milieuvriendelijke en gesimuleerde media zijn gebruikt om met succes de volgende in situ verworven voormalige lede…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag de afstamming van informatie en mentorschap erkennen die deze technieken in de loop der jaren heeft beïnvloed/ontwikkeld. Dr. Hamilton-Brehm is als voormalig afgestudeerde student, postdoc en huidige professor veel dank verschuldigd aan degenen die de tijd hebben genomen om anaërobe technieken te onderwijzen: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser en Dr. Brian Hedlund. De Nature Conservancy en American Rivers ondersteunden dit werk door middel van subsidies G21-026-CON-P en AR-CE21GOS373, respectievelijk. Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen in dit artikel zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de mening van de Nature Conservancy of American Rivers. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het SIU Advanced Energy Institute, dat dankbaar is voor financiering die is toegekend via de Advanced Energy Resource Board. NGS werd uitgevoerd door LC Sciences.

Materials

General Materials
1 L borosillicate bottle Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip Fisher Scientific
10 mL glass pipette Fisher Scientific
100 mL culture bottle Fisher Scientifc
20 mm hand crimper Fisher Scientifc
23 G needle Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle Fisher Scientific
Aluminum seal Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length Fisher Scientifc
Corer Giddings Machine Company  Assembled from company parts
Gas manifold Swagelok Assembled from many different parts
Lighter Lowe's
N2 gas Airgas
Nitrile gloves Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles) Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles) Ace Glass
Stirring hot plate Corning
Trace minerals ATCC
Vitamins ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper Ace Glass
#7 rubber stopper Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve Amazon
10 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle Fisher Scientific
5/16" – 1/4" hose barb adapter fitting Amazon
60 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap Ace Glass 7623-20
Balloon Party City
Borosillicate bioreactor Allen Scientific Glass Custom made upon request
Drill Lowe's
Female luer lock adapter coupler Amazon
GL14 open top cap Ace Glass 7621-04
GL18 open top cap Ace Glass 7621-08
GL45 open top cap Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap Ace Glass 7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap Ace Glass 7625-07
Ring stand Fisher Scientific
Ring stand chain clamp Amazon
Ring stand clamp Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od Grainger 55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap Ace Glass 7623-22
Three-way stopcock Amazon
Two-way stopcock Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump VWR
Water bath Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes Ace Glass 9096-49
Wire Lowe's
Zip tie Lowe's

References

  1. Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
  2. Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
  3. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  4. Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
  5. Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the’omics’ age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
  6. Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
  7. Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
  8. Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
  9. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
  10. Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
  11. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
  12. Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
  13. . Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013)
  14. . Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018)
  15. Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
  16. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  17. Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
  18. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
  19. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
  20. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
  21. Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).

Play Video

Cite This Article
Zimmerman, T., Leamon, G., Dillenburg, G., Egge, B., Pierce, J., Elliott, B., Murphy, T., Brooks, M., Hamilton-Brehm, S. D. A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms. J. Vis. Exp. (203), e66228, doi:10.3791/66228 (2024).

View Video