Un insieme di mezzi di comunicazione simulati informati in situ per la coltura di microrganismi anaerobici acquisiti nell'ambiente

La maggior parte dei microrganismi rimane non coltivata; Ciò è supportato dalla grande disparità tra le cellule osservata attraverso la microscopia, contrastata dai pochi microrganismi coltivati con successo utilizzando piastre di agar. Staley e Konopka chiamarono questa disparità “Anomalia del Conteggio delle Grandi Placche”¹. La diversità stimata non contabilizzata è supportata da dati metagenomici e metatrascrittomici che mostrano molti nuovi generi distribuiti in curve di abbondanza di rango provenienti da diversi ambienti². I microrganismi che sono stati osservati (generalmente mediante sequenziamento casuale di una comunità microbica) ma che non sono stati coltivati sono stati definiti “materia oscura microbica”^3,4.

Nell’era della -omica, la coltura di microrganismi rimane fondamentale per valutare appieno i dati genomici e verificare la funzione/fenotipo dei geni presenti. Il sequenziamento di microrganismi in coltura è ancora l’unico modo per ottenere con sicurezza genomi completi fino a quando tecnologie come la metagenomica shotgun e i genomi assemblati con metagenoma dall’ambiente non diventeranno infallibili⁵. Le valutazioni genomiche accoppiate con microrganismi in coltura forniscono forti inferenze per la comprensione della “materia oscura microbica”. Molti membri della “materia oscura microbica” svolgono funzioni cruciali che hanno un impatto sul ciclo dei nutrienti e di altri elementi e sulla produzione di preziosi prodotti naturali, supportano i sistemi ecologici e svolgono servizi ecologici. Dal punto di vista medico, circa la metà di tutti i prodotti farmaceutici attualmente commercializzati sono prodotti e derivati di prodotti batterici, e si sospetta che la profilazione di specie non coltivate riveli gli antibiotici del futuro. Per ottenere l’accesso a questa maggioranza incolta, è necessario aumentare una varietà di metodologie di coltivazione⁶. Tra i membri della “materia oscura microbica”, i microrganismi oligotrofi anaerobici sono in gran parte sottostimati e probabilmente detengono percorsi biochimici ecologicamente e industrialmente^preziosi, rendendoli importanti bersagli della coltura. Tuttavia, i microrganismi oligotrofi anaerobici sono più difficili da coltivare rispetto alle loro controparti aerobiche e copiotrofiche a causa dei tempi di incubazione più lunghi spesso richiesti, delle condizioni esigenti (ad esempio, particolari temperature in vitro non standard) e dell’uso di ricette di terreni specializzati.

Le attuali tecniche di sviluppo per coltivare membri della “materia oscura microbica”, compresi i nuovi microrganismi oligotrofi anaerobici, hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione e aumentato la rappresentazione di questi microrganismi all’interno dell’albero filogenetico. Le attuali tecniche che utilizzano terreni informati per la coltura di nuovi microrganismi (cioè terreni derivati dalla conoscenza del/i microrganismo/i di interesse) possono essere suddivise in tre metodi distinti. Il primo dei metodi prevede la rimozione diretta di una sezione discreta dell’ambiente per il trasferimento in una camera di crescita in vitro che contiene già i microrganismi di interesse all’interno di una membrana. La sezione discreta (ad esempio, l’acqua di mare) agisce per fornire ai microrganismi di interesse l’habitat geochimico che utilizzano in situ, mentre la membrana arresta il movimento delle cellule attraverso (le cellule di interesse rimarranno all’interno; le cellule estranee che sono arrivate con la sezione discreta rimarranno all’esterno). Includendo composti naturalmente disponibili per i microrganismi bersaglio nel loro habitat naturale, tali microrganismi possono essere coltivati⁸. Il secondo metodo utilizza la metatrascrittomica o la genomica per chiarire le capacità metaboliche, fornendo indizi su parametri di coltura ristretti per un disegno mirato del terreno. Questo approccio fornisce un profilo eco-fisiologico che può essere utilizzato per indirizzare l’arricchimento di specifici tipi di microrganismi da un ambiente. Le disposizioni del terreno sono adattate ai geni identificati presenti che si presume supportino i microrganismi bersaglio per ridurre la diversità di arricchimento,9,10. Un avvertimento è che le informazioni genomiche non deducono direttamente l’espressione dei geni, mentre le informazioni trascrittomiche sì.

Il terzo metodo comprende i media informati e simulati dal punto di vista ambientale, distinti dal primo metodo, che non simula i media, ma utilizza l’ambiente direttamente come fonte di media. Questo terzo metodo richiede la ricognizione ambientale della geochimica di un sito di campo contenente microrganismi di interesse. Con questa conoscenza, i componenti primari e i parametri fisici vengono identificati per produrre un mezzo simulato informato sull’ambiente. Il terreno riceve quindi un’infusione diretta di sedimenti o liquidi contenenti microrganismi dall’ambiente nel terreno. Questo metodo è particolarmente utile nei casi in cui il microbiologo colturatore non ha accesso a quantità sufficienti di ambiente sorgente (come necessario per il primo metodo) né a dati metatrascrittomici o genomici appropriati (come necessario per il secondo).

Il seguente protocollo è un esempio del terzo metodo; Si basa e mira a simulare gli ambienti di interesse. All’interno del protocollo vengono presentate in parallelo tre ricette di terreni naïve mirate a diverse colture di microrganismi anaerobi acquisite sul campo. Le tre colture rappresentate sono colture miste originate dal suolo (di seguito, coltura mista del suolo), colture miste originate dall’interno di un pozzo trivellato (di seguito, coltura mista da pozzo) e un metanogeno isolato proveniente dall’interno di un pozzo trivellato (di seguito, metanogeno isolato da pozzo). Le identità composte e le quantità nelle ricette multimediali qui condivise sono intese come una guida iniziale; Sono in grado e incoraggiati ad essere personalizzati in base all’ambiente del lettore e ai microrganismi di interesse.