Summary

Набор смоделированных сред in situ для культивирования анаэробных микроорганизмов, приобретенных в окружающей среде

Published: January 12, 2024
doi:

Summary

Основное внимание в этой статье уделяется подробному описанию передового опыта создания сред для привередливых анаэробных микроорганизмов, полученных из окружающей среды. Эти методы помогают управлять анаэробными культурами и могут применяться для поддержки роста неуловимых некультивируемых микроорганизмов, «микробной темной материи».

Abstract

Культурально-зависимое исследование анаэробных микроорганизмов опирается на методологическую компетентность. Эти методы должны создавать и поддерживать подходящие условия роста (например, pH и источники углерода) для анаэробных микроорганизмов, а также позволять извлекать образцы без ущерба для искусственной среды. С этой целью методы, основанные на информации и моделирующие среду in situ, могут оказать большую помощь в культивировании микроорганизмов из этой среды. В этой статье мы описываем анаэробный метод культивирования наземных и подповерхностных микроорганизмов in situ , основанный на анаэробном отборе проб с минимальными возмущениями. В этом протоколе подробно описывается производство настраиваемой анаэробной жидкой среды, а также получение и выращивание анаэробных микроорганизмов в окружающей среде in vitro . Протокол также охватывает важнейшие компоненты анаэробного биореактора, используемого для моделирования условий окружающей среды осадка и анаэробных жидких сред для культур, полученных в окружающей среде. Мы включили предварительные данные секвенирования следующего поколения из поддерживаемого микробиома в течение всего срока службы биореактора, где активная культура динамически корректировалась в ответ на экспериментальный источник углерода.

Introduction

Большинство микроорганизмов остаются некультивированными; Это подтверждается большим несоответствием между клетками, наблюдаемыми с помощью микроскопии, в отличие от нескольких микроорганизмов, успешно культивируемых с использованием агаровых пластин. Стейли и Конопка назвали это несоответствие «Аномалией большого количества плит»1. Оценка неучтенного разнообразия подтверждается метагеномными и метатранскриптомными данными, показывающими множество новых родов, распределенных по ранговым кривым численности из нескольких различных сред2. Микроорганизмы, которые были обнаружены (как правило, путем случайного секвенирования микробного сообщества), но не культивировались, были названы «микробной темной материей»3,4.

В эпоху омиксов культивирование микроорганизмов остается обязательным условием для полной оценки геномных данных и проверки функции/фенотипа присутствующих генов. Секвенирование культивируемых микроорганизмов по-прежнему остается единственным способом уверенного получения полных геномов до тех пор, пока такие технологии, как метагеномика дробовика и метагеном, собранные из окружающей среды, не станут допустимо непогрешимыми. Геномные оценки в сочетании с культивируемыми микроорганизмами дают убедительные выводы для понимания «микробной темной материи». Многие представители «микробной темной материи» выполняют важнейшие функции, влияющие на круговорот питательных и других элементов и производство ценных природных продуктов, поддерживают экологические системы и оказывают экологические услуги. С медицинской точки зрения, около половины всех продаваемых в настоящее время фармацевтических препаратов являются продуктами и производными продуктов из бактерий, и предполагается, что профилирование некультивируемых видов позволит выявить антибиотики будущего. Чтобы получить доступ к этому некультурному большинству, необходимо расширить разнообразие методологий культивирования. Среди представителей «микробной темной материи» анаэробные олиготрофные микроорганизмы в значительной степени недоописаны и,вероятно, обладают экологически и промышленно ценными биохимическими путями, что делает их важными мишенями для культивирования. Однако анаэробные олиготрофные микроорганизмы труднее культивировать, чем их аэробные и копиотрофные аналоги, из-за часто требуемого более длительного времени инкубации, привередливых условий (например, особых нестандартных температур in vitro ) и использования специализированных рецептур сред.

Современные методы культивирования членов «микробной темной материи», включая новые анаэробные олиготрофные микроорганизмы, значительно улучшили наше понимание и увеличили представленность этих микроорганизмов в филогенетическом древе. Существующие методы, использующие информированные среды для культивирования новых микроорганизмов (т.е. среды, полученные с использованием знаний об интересующем микроорганизме (микроорганизмах), можно разделить на три различных метода. Первый из методов заключается в прямом удалении дискретного участка среды для переноса в камеру для роста in vitro, которая уже содержит интересующие микроорганизмы внутри мембраны. Дискретная секция (например, морская вода) обеспечивает интересующие микроорганизмы геохимической средой обитания, которую они используют in situ, в то время как мембрана останавливает движение клеток поперек (интересующие клетки останутся внутри; посторонние клетки, прибывшие с дискретным участком, останутся снаружи). Путем включения соединений, естественным образом доступных для целевых микроорганизмов в их естественной среде обитания, такие микроорганизмы могут культивироваться8. Второй метод использует метатранскриптомику или геномику для выяснения метаболических возможностей, предоставляя ключи к узким параметрам культивирования для целевого дизайна среды. Этот подход обеспечивает эколого-физиологический профиль, который может быть использован для целенаправленного обогащения определенных типов микроорганизмов из окружающей среды. Средства среды предназначены для выявления присутствующих генов, которые, как предполагается, поддерживают целевой микроорганизм (микроорганизмы) для уменьшения разнообразия обогащения,9,10. Одно из предостережений заключается в том, что геномная информация не дает прямого вывода об экспрессии генов, в то время как транскриптомная информация делает это.

Третий метод включает в себя экологически информированные и смоделированные среды, в отличие от первого метода, который не моделирует среду, а использует окружающую среду непосредственно в качестве источника среды. Этот третий метод требует экологической разведки геохимии полевого участка, содержащего интересующие микроорганизмы. Обладая этими знаниями, основные компоненты и физические параметры определяются для создания экологически обоснованной моделируемой среды. Затем среда получает прямую инфузию осадка или жидкости, содержащей микроорганизмы, из окружающей среды в среду. Этот метод особенно ценен в тех случаях, когда микробиолог, занимающийся культивированием, не имеет доступа к достаточному количеству исходной среды (как это необходимо для первого метода) или к соответствующим метатранскриптомным или геномным данным (как это необходимо для второго метода).

Следующий протокол является примером третьего метода; Он основан на информации и направлен на моделирование интересующих сред. В протоколе параллельно представлены три наивных рецепта среды, нацеленных на различные анаэробные культуры микроорганизмов, полученные в полевых условиях. Представлены три культуры: смешанные культуры, происходящие из почвы (далее — смешанная почвенная культура), смешанные культуры, происходящие из скважины (далее — скважинная смешанная культура) и изолированный метаноген, происходящий из скважины (далее — скважинный изолированный метаноген). Составные тождества и количества в рецептах СМИ, представленных здесь, предназначены для начального руководства; Они могут и поощряются к адаптации к окружающей среде читателя и интересующим его микроорганизмам.

Protocol

1. Производство настраиваемой анаэробной жидкой среды Среда для флаконов для культур (производство 500 мл)Отмерьте и добавьте соединения в бутылку объемом 1 л и отрегулируйте pH, используя столбец в таблице 1 , соответствующий интересующей читателя культуре (ко?…

Representative Results

Здесь мы показываем результаты исследования биореактора с использованием метода приготовления скважинной смешанной питательной среды и метода настройки биореактора, как описано в настоящем документе. Скважинная смешанная питательная среда была модифицирована таким образом, чтобы ?…

Discussion

Раздел этого протокола (раздел 1) обязан своей структурой модифицированной методике Хангейта Миллера и Волина17, которая широко использовалась с момента ее публикации. Практичность этого расширенного протокола обусловлена его описательным характером и сочетанием с получ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы отметить преемственность информации и наставничества, которые влияли/развивали эти методы на протяжении многих лет. Доктор Гамильтон-Брем, как бывший аспирант, постдок и нынешний профессор, в долгу перед теми, кто нашел время для обучения анаэробным техникам: доктору Майку Адамсу, доктору Герти Шут, доктору Джиму Элкинсу, доктору Мирче Подару, доктору Дуэйну Мозеру и доктору Брайану Хедлунду. Организации Nature Conservancy и American Rivers поддержали эту работу грантами G21-026-CON-P и AR-CE21GOS373 соответственно. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Nature Conservancy или American Rivers. Эта работа была поддержана грантом Института перспективной энергетики SIU, который с благодарностью признает финансирование, предоставленное через Совет по перспективным энергетическим ресурсам. NGS был выполнен компанией LC Sciences.

Materials

General Materials
1 L borosillicate bottle Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip Fisher Scientific
10 mL glass pipette Fisher Scientific
100 mL culture bottle Fisher Scientifc
20 mm hand crimper Fisher Scientifc
23 G needle Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle Fisher Scientific
Aluminum seal Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length Fisher Scientifc
Corer Giddings Machine Company  Assembled from company parts
Gas manifold Swagelok Assembled from many different parts
Lighter Lowe's
N2 gas Airgas
Nitrile gloves Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles) Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles) Ace Glass
Stirring hot plate Corning
Trace minerals ATCC
Vitamins ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper Ace Glass
#7 rubber stopper Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve Amazon
10 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle Fisher Scientific
5/16" – 1/4" hose barb adapter fitting Amazon
60 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap Ace Glass 7623-20
Balloon Party City
Borosillicate bioreactor Allen Scientific Glass Custom made upon request
Drill Lowe's
Female luer lock adapter coupler Amazon
GL14 open top cap Ace Glass 7621-04
GL18 open top cap Ace Glass 7621-08
GL45 open top cap Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap Ace Glass 7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap Ace Glass 7625-07
Ring stand Fisher Scientific
Ring stand chain clamp Amazon
Ring stand clamp Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od Grainger 55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap Ace Glass 7623-22
Three-way stopcock Amazon
Two-way stopcock Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump VWR
Water bath Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes Ace Glass 9096-49
Wire Lowe's
Zip tie Lowe's

References

  1. Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
  2. Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
  3. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  4. Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
  5. Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the’omics’ age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
  6. Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
  7. Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
  8. Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
  9. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
  10. Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
  11. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
  12. Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
  13. . Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013)
  14. . Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018)
  15. Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
  16. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  17. Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
  18. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
  19. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
  20. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
  21. Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).

Play Video

Cite This Article
Zimmerman, T., Leamon, G., Dillenburg, G., Egge, B., Pierce, J., Elliott, B., Murphy, T., Brooks, M., Hamilton-Brehm, S. D. A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms. J. Vis. Exp. (203), e66228, doi:10.3791/66228 (2024).

View Video