Eine Reihe von in situ informierten simulierten Medienformaten für die Kultivierung umweltbedingt erworbener anaerober Mikroorganismen

Die meisten Mikroorganismen bleiben unkultiviert; Dies wird durch die große Ungleichheit zwischen den mikroskopisch beobachteten Zellen im Gegensatz zu den wenigen Mikroorganismen unterstützt, die erfolgreich mit Agarplatten kultiviert wurden. Staley und Konopka nannten diese Diskrepanz die “Great Plate Count Anomaly”¹. Die geschätzte unberücksichtigte Diversität wird durch metagenomische und metatranskriptomische Daten gestützt, die zeigen, dass viele neue Gattungen in Rangabundanzkurven aus verschiedenen Umgebungen verteilt sind². Mikroorganismen, die beobachtet wurden (in der Regel durch zufällige Sequenzierung einer mikrobiellen Gemeinschaft), aber nicht kultiviert wurden, wurden als “mikrobielle dunkle Materie” ^{bezeichnet3,4}.

Im Zeitalter der -omics ist die Kultivierung von Mikroorganismen nach wie vor unerlässlich, um genomische Daten vollständig auszuwerten und die Funktion/den Phänotyp der vorhandenen Gene zu überprüfen. Die Sequenzierung kultivierter Mikroorganismen ist immer noch der einzige Weg, um sicher vollständige Genome zu erhalten, bis Technologien wie Schrotflinten-Metagenomik und Metagenom-assemblierte Genome aus der Umwelt zulässig unfehlbar werden⁵. Genomische Bewertungen in Verbindung mit kultivierten Mikroorganismen liefern starke Schlussfolgerungen für das Verständnis der “mikrobiellen dunklen Materie”. Viele Mitglieder der “mikrobiellen Dunklen Materie” erfüllen entscheidende Funktionen, die den Kreislauf von Nährstoffen und anderen Elementen sowie die Produktion wertvoller Naturprodukte beeinflussen, ökologische Systeme unterstützen und ökologische Dienstleistungen erbringen. Aus medizinischer Sicht sind etwa die Hälfte aller derzeit vermarkteten Arzneimittel Produkte und Derivate von Produkten aus Bakterien, und es wird vermutet, dass die Profilierung unkultivierter Spezies die Antibiotika der Zukunft aufzeigt. Um Zugang zu dieser unkultivierten Mehrheit zu erhalten, muss eine Vielzahl von Kultivierungsmethoden erweitert werden⁶. Unter den Mitgliedern der “mikrobiellen dunklen Materie” werden anaerobe oligotrophe Mikroorganismen weitgehend unterschätzt und verfügen wahrscheinlich über ökologisch und industriell wertvolle biochemische Signalwege⁷, was sie zu wichtigen Zielen der Kultivierung macht. Anaerobe oligotrophe Mikroorganismen sind jedoch schwieriger zu kultivieren als ihre aeroben und copiotrophen Gegenstücke, da oft längere Inkubationszeiten, anspruchsvolle Bedingungen (z. B. bestimmte nicht standardmäßige In-vitro-Temperaturen ) und die Verwendung spezieller Medienrezepturen erforderlich sind.

Aktuelle Entwicklungstechniken zur Kultivierung von Mitgliedern der “mikrobiellen dunklen Materie”, einschließlich neuartiger anaerober oligotropher Mikroorganismen, haben unser Verständnis erheblich verbessert und die Repräsentation dieser Mikroorganismen innerhalb des phylogenetischen Baums erhöht. Aktuelle Techniken, die informierte Medien zur Kultivierung neuartiger Mikroorganismen verwenden (d. h. Medien, die aus dem Wissen über den/die interessierenden Mikroorganismus gewonnen werden), können in drei verschiedene Methoden unterteilt werden. Die erste der Methoden beinhaltet die direkte Entfernung eines diskreten Abschnitts der Umgebung für den Transfer in eine In-vitro-Wachstumskammer, die die interessierenden Mikroorganismen bereits in einer Membran enthält. Der diskrete Abschnitt (z. B. Meerwasser) dient dazu, den interessierenden Mikroorganismen den geochemischen Lebensraum zu bieten, den sie in situ nutzen, während die Membran die Bewegung der Zellen stoppt (die interessierenden Zellen bleiben drinnen; fremde Zellen, die mit dem diskreten Abschnitt angekommen sind, bleiben ohne). Durch die Einbeziehung von Verbindungen, die natürlich verfügbar sind, um Mikroorganismen in ihrem natürlichen Lebensraum zu bekämpfen, können solche Mikroorganismen kultiviert werden⁸. Die zweite Methode nutzt Metatranskriptomik oder Genomik, um metabolische Fähigkeiten aufzuklären und Hinweise auf enge Kultivierungsparameter für ein gezieltes Mediumdesign zu liefern. Dieser Ansatz liefert ein ökophysiologisches Profil, mit dem die Anreicherung bestimmter Arten von Mikroorganismen aus einer Umgebung gezielt erreicht werden kann. Die Bestimmungen des Mediums sind auf die identifizierten vorhandenen Gene ausgerichtet, von denen angenommen wird, dass sie den/die Zielmikroorganismus(en) unterstützen, um die Anreicherungsvielfalt zu ^{reduzieren,9,10}. Ein Vorbehalt ist, dass genomische Informationen nicht direkt auf die Expression von Genen schließen, während transkriptomische Informationen dies tun.

Die dritte Methode umfasst umweltinformierte und simulierte Medien, die sich von der ersten Methode unterscheidet, die die Medien nicht simuliert, sondern die Umwelt direkt als Medienquelle nutzt. Diese dritte Methode erfordert eine Umwelterkundung der Geochemie eines Feldstandorts, der Mikroorganismen von Interesse enthält. Mit diesem Wissen werden Primärkomponenten und physikalische Parameter identifiziert, um ein umweltbewusstes simuliertes Medium herzustellen. Das Medium erhält dann eine direkte Infusion von Mikroorganismen-haltigen Sedimenten oder Flüssigkeiten aus der Umgebung in das Medium. Diese Methode ist von besonderem Wert in Fällen, in denen der kultivierende Mikrobiologe weder Zugang zu ausreichenden Mengen an Quellumgebung (wie für die erste Methode erforderlich) noch zu geeigneten metatranskriptomischen oder genomischen Daten (wie für die zweite Methode erforderlich) hat.

Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für die dritte Methode; Es basiert auf interessanten Umgebungen und zielt darauf ab, diese zu simulieren. Drei naive Medienrezepte, die auf verschiedene im Feld erworbene anaerobe Mikroorganismenkulturen abzielen, werden parallel im Protokoll vorgestellt. Bei den drei vertretenen Kulturen handelt es sich um Mischkulturen, die aus dem Boden stammen (im Folgenden “Bodenmischkultur”), Mischkulturen, die aus einem Bohrloch stammen (im Folgenden “Bohrlochmischkultur”) und um ein isoliertes Methanogen, das aus einem Bohrloch stammt (im Folgenden “isoliertes Methanogen” aus dem Bohrloch). Die zusammengesetzten Identitäten und Mengen in den hier geteilten Medienrezepten sind als erster Leitfaden gedacht; Sie können und werden ermutigt, an die Umgebung und die interessierenden Mikroorganismen des Lesers angepasst zu werden.