השראת שבץ איסכמי חריף בעכברים באמצעות טכניקת חסימת העורק האמצעי הדיסטלי
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל חסימת עורק מוחי אמצעי דיסטלי (dMCAO) באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית בעכברי C57BL/6J ומעריכים את ההתנהגות הנוירולוגית והתכונות ההיסטופתולוגיות שלאחר מכן.
Abstract
שבץ איסכמי נותר הגורם העיקרי לתמותה ולפגיעה תפקודית בקרב האוכלוסיות הבוגרות בעולם. רק מיעוט מחולי שבץ איסכמי זכאים לקבל טרומבוליזה תוך וסקולרית או טיפול תרומבקטומיה מכנית בחלון הזמן האופטימלי. בקרב אותם מחלימים משבץ מוחי, כשני שלישים סובלים מהפרעות נוירולוגיות לאורך תקופה ממושכת. ביסוס מודל שבץ איסכמי ניסיוני יציב וניתן לחזרה הוא משמעותי ביותר להמשך חקירת המנגנונים הפתופיזיולוגיים ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות לשבץ איסכמי. עורק המוח האמצעי (MCA) מייצג את המיקום הדומיננטי של שבץ איסכמי בבני אדם, כאשר חסימת MCA משמשת כמודל הנפוץ של איסכמיה מוחית מוקדית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את המתודולוגיה של הקמת מודל חסימת MCA דיסטלי (dMCAO) באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית בעכברי C57BL/6. מכיוון שאתר החסימה ממוקם בענף קליפת המוח של MCA, מודל זה מייצר נגע אוטם בינוני המוגבל לקליפת המוח. אפיון נוירולוגי התנהגותי והיסטופתולוגי הדגים תפקוד מוטורי נראה לעין, ניוון נוירונים והפעלה בולטת של מיקרוגליה ואסטרוציטים במודל זה. לפיכך, מודל עכבר dMCAO זה מספק כלי רב ערך לחקר איסכמיה וערך של פופולריזציה.
Introduction
שבץ מוחי הוא מחלה מוחית חריפה נפוצה המאופיינת בשכיחות גבוהה של נכות ותמותה1. מתוך כלל מקרי השבץ, כמעט 80% שייכים לשבץ איסכמי2. עד כה, פקקת תוך ורידית נותרה אחת ממספר מצומצם של גישות פרודוקטיביות לטיפול בשבץ איסכמי חריף. עם זאת, האפקטיביות של טיפול thrombolytic מוגבל על ידי חלון הזמן האפקטיבי הצר ואת התרחשות של טרנספורמציה hemorrhagic3. בשלב השיקום ארוך הטווח לאחר שבץ איסכמי, מספר לא מבוטל של חולים צפויים לחוות הפרעות נוירולוגיות עמידות4. חקירה נוספת נדרשת בדחיפות כדי לפענח את המנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים של שבץ איסכמי, כמו גם להקל על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות הממוקדות שבץ איסכמי. הקמתו של מודל מהימן וניתן לשכפול של שבץ איסכמי היא חיונית למחקר בסיסי, כמו גם למחקר תרגומי מאוחר יותר בתחום השבץ האיסכמי.
בשנת 1981, Tamura et al. פיתחו מודל איסכמיה מוחית מוקדית על ידי שימוש באלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית באתר הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי (MCA)5. מאז, חוקרים רבים השתמשו במתודולוגיות שונות כגון קשירה, דחיסה או חיתוך כדי לגרום לחסימת MCA דיסטלית (dMCAO) לקביעת מודלים חולפים או קבועים של שבץ איסכמי 6,7,8. בהשוואה למודל חוט הלהט, מודל dMCAO מציג יתרונות בולטים כגון גודל אוטם קטן יותר ושיעור הישרדות גבוה יותר, מה שהופך אותו מתאים יותר לחקר התאוששות תפקודית ארוכת טווח לאחר שבץ איסכמי9. בנוסף, מודל dMCAO מדגים שיעור הישרדות גבוה יותר במכרסמים מזדקנים בהשוואה למודל חוט הלהט, מה שהופך אותו לכלי יתרון לחקר שבץ איסכמי במודלים של קשישים ובעלי חיים נלווים10. מודל שבץ פוטוטרומבוטי (PT) הוכח כבעל מאפיינים של פחות פולשניות כירורגית ושיעור תמותה נמוך משמעותית. עם זאת, מודל PT מציג רמה גבוהה יותר של נמק תאי ובצקת רקמות בהשוואה למודל dMCAO, מה שמוביל להיעדר מחזור בטחונות11. יתר על כן, ראוי לציין כי הנגעים האיסכמיים שנצפו במודל PT נובעים בעיקר מחסימת כלי דם, השונה באופן מהותי מהאיסכמיה המוחית הנגרמת על ידי תסחיף כלי דם גדולים במודל dMCAO12.
במאמר זה, אנו מציגים את המתודולוגיה להשראת מודל dMCAO מורין על ידי קרישת MCA דיסטלי באמצעות קרניוטומיה של חלון עצם קטן. בנוסף, ערכנו בדיקות היסטולוגיות והערכות התנהגותיות כדי לאפיין באופן מקיף את תוצאות העלבונות והשבץ האיסכמי במודל ניסויי זה. אנו שואפים להכיר לחוקרים מודל זה ולהקל על חקירות נוספות של המנגנונים הפתולוגיים של שבץ איסכמי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי של מודל dMCAO electrocoagulation craniotomy, ההליכים הכירורגיים מבוצעים עם פולשניות מינימלית, שבה רק חלק מהשריר הטמפורליס מופרד כדי למתן את ההשפעות השליליות על תפקוד המסטיקציה. כל העכברים התאוששו היטב לאחר ההליך, ללא מקרים נצפים של קשיי האכלה. ניתן להבחין בקלות ב-MCA בעצם הרקתית של העכבר, ו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של מחוז חוביי (2022CFC057).
Materials
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) |
Sigma-Aldrich | 108380 | Dye for TTC staining |
| 24-well culture plate | Corning (USA) | CLS3527 | Vessel for TTC staining |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1101 | Tissue fixation |
| 5% bovine serum albumin | Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd. | AR004 | Non-specific antigen blocking |
| 5-0 Polyglycolic acid suture | Jinhuan Medical Co., Ltd | KCR531 | Material for surgery |
| Anesthesia machine | Midmark Corporation | VMR | Anesthetized animal |
| Antifade mounting medium | Beyotime Biotech | P0131 | Seal for IF staining |
| Automation-tissue-dehydrating machine |
Leica Biosystems (Germany) | TP1020 | Dehydrate tissue |
| Depilatory cream | Veet (France) | 20220328 | Material for surgery |
| Diclofenac sodium gel | Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical Co., Ltd. |
H10950214 | Analgesia for animal |
| Drill tip (0.8 mm) | Rwd Life Science Co., Ltd. | Equipment for surgery | |
| Eosin staining solution | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1001 | Dye for H&E staining |
| Eye ointment | Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd | H44023098 | Material for surgery |
| Fluorescence microscope | Olympus (Japan) | BX51 | Image acquisition |
| GFAP Mouse monoclonal antibody | Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
3670 | Primary antibody for IF staining |
| Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG |
Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
4408 | Second antibody for IF staining |
| Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG |
Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
8889 | Second antibody for IF staining |
| Grip strength meter | Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd. | XR501 | Equipment for behavioral test |
| Hematoxylin staining solution | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1004 | Dye for H&E staining |
| Iba1 Rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab178846 | Primary antibody for IF staining |
| Isoflurane | Rwd Life Science Co., Ltd. | R510-22-10 | Anesthetized animal |
| Laser doppler blood flow meter | Moor Instruments (UK) | moorVMS | Blood flow monitoring |
| Meloxicam | Boehringer-Ingelheim | J20160020 | Analgesia for animal |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd. | 78001 | Equipment for surgery |
| Microsurgical instruments set | Rwd Life Science Co., Ltd. | SP0009-R | Equipment for surgery |
| Microtome | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Tissue section production |
| Microtome blade | Leica Biosystems (Germany) | 819 | Tissue section production |
| Monopolar electrocoagulation generator | Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd. |
CZ0001 | Equipment for surgery |
| Mupirocin ointment | Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd. |
H10930064 | Anti-infection for animal |
| NeuN Rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
24307 | Primary antibody for IF staining |
| Neutral balsam | Absin Bioscience | abs9177 | Seal for H&E staining |
| Paraffin embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | Euthanized animal |
| Phosphate buffered saline | Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd | C0221A | Rinsing for tissue section |
| Shaver | Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd. |
CP-9200 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution | Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd. | P0083 | Antigen retrieval for IF staining |
References
- Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC Focus Seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
- GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2019).
- Joo, H., Wang, G., George, M. G. A literature review of cost-effectiveness of intravenous recombinant tissue plasminogen activator for treating acute ischemic stroke. Stroke Vasc Neurol. 2 (2), 73-83 (2017).
- Jones, A. T., O’Connell, N. K., David, A. S. Epidemiology of functional stroke mimic patients: a systematic review and meta-analysis. Eur J Neurol. 27 (1), 18-26 (2020).
- Tamura, A., et al. Focal cerebral ischaemia in the rat: Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Candelario-Jalil, E., Paul, S. Impact of aging and comorbidities on ischemic stroke outcomes in preclinical animal models: A translational perspective. J Exp Neurol. 335, 113494 (2021).
- Zuo, X., et al. Attenuation of secondary damage and Aβ deposits in the ipsilateral thalamus of dMCAO rats through reduction of cathepsin B by bis(propyl)-cognitin, a multifunctional dimer. Neuropharmacology. 162, 107786 (2020).
- Shabani, Z., Farhoudi, M., Rahbarghazi, R., Karimipour, M., Mehrad, H. Cellular, histological, and behavioral pathological alterations associated with the mouse model of photothrombotic ischemic stroke. J Chem Neuroanat. 130, 102261 (2023).
- Caleo, M. Rehabilitation and plasticity following stroke: Insights from rodent models. Neuroscience. 311, 180-194 (2015).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. J Vis Exp. (89), e51729 (2014).
- Lavayen, B. P., et al. Neuroprotection by the cannabidiol aminoquinone VCE-004.8 in experimental ischemic stroke in mice. Neurochem Int. 165, 105508 (2023).
- Hu, K., et al. Cathepsin B knockout confers significant brain protection in the mouse model of stroke. J Exp Neurol. 368, 114499 (2023).
- Yu, S. P., et al. Optochemogenetic stimulation of transplanted iPS-NPCs enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. J Neurosci. 39 (33), 6571-6594 (2019).
- Lin, Y. H., et al. Opening a new time window for treatment of stroke by targeting HDAC2. J Neurosci. 37 (28), 6712-6728 (2017).
- Shi, X. F., Ai, H., Lu, W., Cai, F. SAT: Free software for the semi-automated analysis of rodent brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining. Front Neurosci. 13, 102 (2019).
- Jensen, E. C., et al. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat Rec. 296 (3), 378-381 (2013).
- Donahue, J., Wintermark, M. Perfusion CT and acute stroke imaging: foundations, applications, and literature review. J Neuroradiol. 42 (1), 21-29 (2015).
- Sun, M., et al. Long-term L-3-n-butylphthalide pretreatment attenuates ischemic brain injury in mice with permanent distal middle cerebral artery occlusion through the Nrf2 pathway. Heliyon. 8 (7), e09909 (2022).
- Balkaya, M. G., Trueman, R. C., Boltze, J., Corbett, D., Jolkkonen, J. Behavioral outcome measures to improve experimental stroke research. Behav Brain Res. 352, 161-171 (2018).
- Hao, T., et al. Inflammatory mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury with treatment of stepharine in rats. Phytomedicine. 79, 153353 (2020).
- Pietrogrande, G., et al. Low oxygen post conditioning prevents thalamic secondary neuronal loss caused by excitotoxicity after cortical stroke. Sci Rep. 9 (1), 4841 (2019).
- Shi, X., et al. Stroke subtype-dependent synapse elimination by reactive gliosis in mice. Nat Commun. 12 (1), 6943 (2021).
- Chen, W. C., et al. Aryl hydrocarbon receptor modulates stroke-induced astrogliosis and neurogenesis in the adult mouse brain. JNeuroinflammation. 16 (1), 187 (2019).
