Inductie van acute ischemische beroerte bij muizen met behulp van de distale occlusietechniek van de middelste slagader
Summary
Hier presenteren we een protocol om een distaal occlusiemodel van de middelste hersenslagader (dMCAO) op te stellen door middel van transcraniële elektrocoagulatie bij C57BL/6J-muizen en evalueren we het daaropvolgende neurologische gedrag en histopathologische kenmerken.
Abstract
Ischemische beroerte blijft de belangrijkste oorzaak van mortaliteit en functionele beperkingen onder de volwassen populaties wereldwijd. Slechts een minderheid van de patiënten met een ischemische beroerte komt in aanmerking voor intravasculaire trombolyse of mechanische trombectomietherapie binnen het optimale tijdvenster. Van de overlevenden van een beroerte lijdt ongeveer tweederde gedurende een langere periode aan neurologische disfuncties. Het opzetten van een stabiel en herhaalbaar experimenteel model voor ischemische beroertes is uiterst belangrijk voor verder onderzoek naar de pathofysiologische mechanismen en het ontwikkelen van effectieve therapeutische strategieën voor ischemische beroerte. De middelste hersenslagader (MCA) vertegenwoordigt de overheersende locatie van ischemische beroerte bij mensen, waarbij de MCA-occlusie dient als het vaak gebruikte model van focale cerebrale ischemie. In dit protocol beschrijven we de methodologie voor het vaststellen van het distale MCA-occlusiemodel (dMCAO) door middel van transcraniële elektrocoagulatie bij C57BL/6-muizen. Aangezien de occlusieplaats zich aan de corticale tak van MCA bevindt, genereert dit model een matig infarct laesie dat beperkt is tot de cortex. Neurologische gedrags- en histopathologische karakterisering hebben zichtbare motorische disfunctie, neurondegeneratie en uitgesproken activering van microglia en astrocyten in dit model aangetoond. Dit dMCAO-muismodel biedt dus een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van de ischemieberoerte en de waarde van popularisering.
Introduction
Beroerte is een veel voorkomende acute cerebrovasculaire aandoening die wordt gekenmerkt door een hoge incidentie van invaliditeit en sterfte1. Van alle gevallen van een beroerte behoort bijna 80% tot ischemische beroerte2. Tot nu toe blijft intraveneuze trombolyse een van een beperkt aantal productieve benaderingen voor de behandeling van acute ischemische beroerte. De effectiviteit van trombolytische behandeling wordt echter beperkt door het smalle effectieve tijdvenster en het optreden van hemorragische transformatie3. In de langdurige revalidatiefase na een ischemische beroerte zal een aanzienlijk aantal patiënten waarschijnlijk duurzame neurologische disfuncties ervaren4. Verder onderzoek is dringend nodig om de onderliggende pathofysiologische mechanismen van ischemische beroerte te ontrafelen en om de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën gericht op ischemische beroerte te vergemakkelijken. De oprichting van een betrouwbaar en reproduceerbaar model van ischemische beroerte is cruciaal voor fundamenteel onderzoek en daaropvolgend translationeel onderzoek op het gebied van ischemische beroerte.
In 1981 ontwikkelden Tamura et al. een focaal cerebraal ischemiemodel door gebruik te maken van transcraniële elektrocoagulatie op de proximale plaats van de middelste hersenslagader (MCA)5. Sindsdien hebben talloze onderzoekers verschillende methodologieën gebruikt, zoals ligatie, compressie of clipping om distale MCA-occlusie (dMCAO) te induceren voor het opstellen van voorbijgaande of permanente ischemische beroertemodellen 6,7,8. Vergeleken met het filamentmodel vertoont het dMCAO-model opmerkelijke voordelen, zoals een kleinere infarctgrootte en een hoger overlevingspercentage, waardoor het geschikter is voor het onderzoeken van functioneel herstel op lange termijn na ischemische beroerte9. Bovendien vertoont het dMCAO-model een hoger overlevingspercentage bij oudere knaagdieren in vergelijking met het filamentmodel, waardoor het een voordelig hulpmiddel is voor het onderzoeken van ischemische beroerte bij oudere en comorbide diermodellen10. Het is aangetoond dat het fototrombotische (PT) beroertemodel de kenmerken bezit van minder chirurgische invasiviteit en een significant laag sterftecijfer. Het PT-model vertoont echter een grotere mate van cellulaire necrose en weefseloedeem in vergelijking met het dMCAO-model, wat leidt tot de afwezigheid van collaterale circulatie11. Bovendien is het opmerkelijk dat de ischemische laesies die in het PT-model worden waargenomen, voornamelijk het gevolg zijn van microvasculaire occlusie, wat aanzienlijk verschilt van de cerebrale ischemie geïnduceerd door embolie van grote bloedvaten in het dMCAO-model12.
In dit artikel presenteren we de methodologie voor het induceren van het dMCAO-model van muizen door de distale MCA te coaguleren via craniotomie van een klein botvenster. Daarnaast hebben we histologische onderzoeken en gedragsevaluaties uitgevoerd om de ischemische beledigingen en beroerte-uitkomsten in dit experimentele model uitgebreid te karakteriseren. We willen onderzoekers kennis laten maken met dit model en verder onderzoek naar de pathologische mechanismen van ischemische beroerte vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het huidige protocol van het craniotomie-elektrocoagulatie-dMCAO-model worden de chirurgische ingrepen uitgevoerd met minimale invasiviteit, waarbij slechts een deel van de temporalis-spier wordt gescheiden om de nadelige effecten op de kauwfunctie te verminderen. De muizen herstelden allemaal goed na de procedure, zonder waargenomen gevallen van voedingsproblemen. De MCA kan gemakkelijk worden onderscheiden in het slaapbeen van de muis, waardoor een nauwkeurige identificatie van geschikte craniotomielocaties mogelijk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de subsidies van de Nature Science Foundation van de provincie Hubei (2022CFC057).
Materials
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) |
Sigma-Aldrich | 108380 | Dye for TTC staining |
| 24-well culture plate | Corning (USA) | CLS3527 | Vessel for TTC staining |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1101 | Tissue fixation |
| 5% bovine serum albumin | Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd. | AR004 | Non-specific antigen blocking |
| 5-0 Polyglycolic acid suture | Jinhuan Medical Co., Ltd | KCR531 | Material for surgery |
| Anesthesia machine | Midmark Corporation | VMR | Anesthetized animal |
| Antifade mounting medium | Beyotime Biotech | P0131 | Seal for IF staining |
| Automation-tissue-dehydrating machine |
Leica Biosystems (Germany) | TP1020 | Dehydrate tissue |
| Depilatory cream | Veet (France) | 20220328 | Material for surgery |
| Diclofenac sodium gel | Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical Co., Ltd. |
H10950214 | Analgesia for animal |
| Drill tip (0.8 mm) | Rwd Life Science Co., Ltd. | Equipment for surgery | |
| Eosin staining solution | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1001 | Dye for H&E staining |
| Eye ointment | Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd | H44023098 | Material for surgery |
| Fluorescence microscope | Olympus (Japan) | BX51 | Image acquisition |
| GFAP Mouse monoclonal antibody | Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
3670 | Primary antibody for IF staining |
| Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG |
Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
4408 | Second antibody for IF staining |
| Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG |
Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
8889 | Second antibody for IF staining |
| Grip strength meter | Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd. | XR501 | Equipment for behavioral test |
| Hematoxylin staining solution | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1004 | Dye for H&E staining |
| Iba1 Rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab178846 | Primary antibody for IF staining |
| Isoflurane | Rwd Life Science Co., Ltd. | R510-22-10 | Anesthetized animal |
| Laser doppler blood flow meter | Moor Instruments (UK) | moorVMS | Blood flow monitoring |
| Meloxicam | Boehringer-Ingelheim | J20160020 | Analgesia for animal |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd. | 78001 | Equipment for surgery |
| Microsurgical instruments set | Rwd Life Science Co., Ltd. | SP0009-R | Equipment for surgery |
| Microtome | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Tissue section production |
| Microtome blade | Leica Biosystems (Germany) | 819 | Tissue section production |
| Monopolar electrocoagulation generator | Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd. |
CZ0001 | Equipment for surgery |
| Mupirocin ointment | Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd. |
H10930064 | Anti-infection for animal |
| NeuN Rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
24307 | Primary antibody for IF staining |
| Neutral balsam | Absin Bioscience | abs9177 | Seal for H&E staining |
| Paraffin embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | Euthanized animal |
| Phosphate buffered saline | Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd | C0221A | Rinsing for tissue section |
| Shaver | Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd. |
CP-9200 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution | Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd. | P0083 | Antigen retrieval for IF staining |
References
- Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC Focus Seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
- GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2019).
- Joo, H., Wang, G., George, M. G. A literature review of cost-effectiveness of intravenous recombinant tissue plasminogen activator for treating acute ischemic stroke. Stroke Vasc Neurol. 2 (2), 73-83 (2017).
- Jones, A. T., O’Connell, N. K., David, A. S. Epidemiology of functional stroke mimic patients: a systematic review and meta-analysis. Eur J Neurol. 27 (1), 18-26 (2020).
- Tamura, A., et al. Focal cerebral ischaemia in the rat: Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Candelario-Jalil, E., Paul, S. Impact of aging and comorbidities on ischemic stroke outcomes in preclinical animal models: A translational perspective. J Exp Neurol. 335, 113494 (2021).
- Zuo, X., et al. Attenuation of secondary damage and Aβ deposits in the ipsilateral thalamus of dMCAO rats through reduction of cathepsin B by bis(propyl)-cognitin, a multifunctional dimer. Neuropharmacology. 162, 107786 (2020).
- Shabani, Z., Farhoudi, M., Rahbarghazi, R., Karimipour, M., Mehrad, H. Cellular, histological, and behavioral pathological alterations associated with the mouse model of photothrombotic ischemic stroke. J Chem Neuroanat. 130, 102261 (2023).
- Caleo, M. Rehabilitation and plasticity following stroke: Insights from rodent models. Neuroscience. 311, 180-194 (2015).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. J Vis Exp. (89), e51729 (2014).
- Lavayen, B. P., et al. Neuroprotection by the cannabidiol aminoquinone VCE-004.8 in experimental ischemic stroke in mice. Neurochem Int. 165, 105508 (2023).
- Hu, K., et al. Cathepsin B knockout confers significant brain protection in the mouse model of stroke. J Exp Neurol. 368, 114499 (2023).
- Yu, S. P., et al. Optochemogenetic stimulation of transplanted iPS-NPCs enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. J Neurosci. 39 (33), 6571-6594 (2019).
- Lin, Y. H., et al. Opening a new time window for treatment of stroke by targeting HDAC2. J Neurosci. 37 (28), 6712-6728 (2017).
- Shi, X. F., Ai, H., Lu, W., Cai, F. SAT: Free software for the semi-automated analysis of rodent brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining. Front Neurosci. 13, 102 (2019).
- Jensen, E. C., et al. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat Rec. 296 (3), 378-381 (2013).
- Donahue, J., Wintermark, M. Perfusion CT and acute stroke imaging: foundations, applications, and literature review. J Neuroradiol. 42 (1), 21-29 (2015).
- Sun, M., et al. Long-term L-3-n-butylphthalide pretreatment attenuates ischemic brain injury in mice with permanent distal middle cerebral artery occlusion through the Nrf2 pathway. Heliyon. 8 (7), e09909 (2022).
- Balkaya, M. G., Trueman, R. C., Boltze, J., Corbett, D., Jolkkonen, J. Behavioral outcome measures to improve experimental stroke research. Behav Brain Res. 352, 161-171 (2018).
- Hao, T., et al. Inflammatory mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury with treatment of stepharine in rats. Phytomedicine. 79, 153353 (2020).
- Pietrogrande, G., et al. Low oxygen post conditioning prevents thalamic secondary neuronal loss caused by excitotoxicity after cortical stroke. Sci Rep. 9 (1), 4841 (2019).
- Shi, X., et al. Stroke subtype-dependent synapse elimination by reactive gliosis in mice. Nat Commun. 12 (1), 6943 (2021).
- Chen, W. C., et al. Aryl hydrocarbon receptor modulates stroke-induced astrogliosis and neurogenesis in the adult mouse brain. JNeuroinflammation. 16 (1), 187 (2019).
