Индукция острого ишемического инсульта у мышей с использованием техники окклюзии дистального отдела средней артерии
Summary
В данной работе мы представляем протокол для установления модели дистальной окклюзии средней мозговой артерии (dMCAO) с помощью транскраниальной электрокоагуляции у мышей C57BL/6J и оценки последующего неврологического поведения и гистопатологических особенностей.
Abstract
Ишемический инсульт остается преобладающей причиной смертности и функциональных нарушений среди взрослого населения во всем мире. Только меньшинство пациентов с ишемическим инсультом имеют право на получение внутрисосудистого тромболизиса или механической тромбэктомии в течение оптимального временного окна. Среди тех, кто пережил инсульт, около двух третей страдают от неврологических дисфункций в течение длительного периода времени. Создание стабильной и повторяемой экспериментальной модели ишемического инсульта чрезвычайно важно для дальнейшего изучения патофизиологических механизмов и разработки эффективных терапевтических стратегий при ишемическом инсульте. Средняя мозговая артерия (МКА) представляет собой преобладающее место ишемического инсульта у человека, при этом окклюзия МКА служит часто используемой моделью фокальной ишемии головного мозга. В данном протоколе мы описываем методологию создания модели дистальной окклюзии MCA (dMCAO) с помощью транскраниальной электрокоагуляции у мышей C57BL/6. Поскольку сайт окклюзии расположен в корковой ветви МЦА, эта модель генерирует умеренное инфарктное поражение, ограниченное корой. Неврологические поведенческие и гистопатологические характеристики продемонстрировали видимую двигательную дисфункцию, дегенерацию нейронов и выраженную активацию микроглии и астроцитов в этой модели. Таким образом, эта мышиная модель dMCAO представляет собой ценный инструмент для исследования ишемического инсульта и достойна популяризации.
Introduction
Инсульт является распространенным острым цереброваскулярным заболеванием, характеризующимся высокой частотой инвалидности и летального исхода1. Из всех случаев инсульта почти 80% относятся к ишемическому инсульту2. До настоящего времени внутривенный тромболизис остается одним из ограниченного числа продуктивных подходов к лечению острого ишемического инсульта. Однако эффективность тромболитического лечения ограничена узким эффективным временным окном и возникновением геморрагической трансформации3. На этапе долгосрочной реабилитации после ишемического инсульта у значительного числа пациентов вероятны стойкие неврологические дисфункции4. Срочно необходимы дальнейшие исследования, чтобы разгадать основные патофизиологические механизмы ишемического инсульта, а также способствовать разработке новых терапевтических стратегий, нацеленных на ишемический инсульт. Создание надежной и воспроизводимой модели ишемического инсульта имеет решающее значение для фундаментальных исследований, а также для последующих трансляционных исследований в области ишемического инсульта.
В 1981 году Tamura et al. разработали модель фокальной ишемии головного мозга с использованием транскраниальной электрокоагуляции в проксимальном участке средней мозговой артерии (МКА)5. С тех пор многие исследователи использовали различные методологии, такие как лигирование, компрессия или клиппинг, для индуцирования дистальной окклюзии MCA (dMCAO) для создания моделей транзиторного или постоянного ишемического инсульта 6,7,8. По сравнению с филаментной моделью, модель dMCAO демонстрирует заметные преимущества, такие как меньший размер инфаркта и более высокая выживаемость, что делает ее более подходящей для исследования долгосрочного функционального восстановления после ишемического инсульта9. Кроме того, модель dMCAO демонстрирует более высокую выживаемость у пожилых грызунов по сравнению с филаментной моделью, что делает ее предпочтительным инструментом для исследования ишемического инсульта у пожилых и коморбидных животных моделей10. Было продемонстрировано, что фототромботическая (ПТ) модель инсульта обладает характеристиками меньшей хирургической травматичности и значительно более низкой смертности. Тем не менее, модель PT демонстрирует большую степень клеточного некроза и отека тканей по сравнению с моделью dMCAO, что приводит к отсутствию коллатерального кровообращения11. Кроме того, следует отметить, что ишемические поражения, наблюдаемые в модели ПТ, преимущественно возникают в результате микрососудистой окклюзии, которая существенно отличается от ишемии головного мозга, вызванной эмболией крупных сосудов в модели dMCAO12.
В этой статье мы представляем методологию индукции мышиной модели dMCAO путем коагуляции дистального отдела MCA с помощью краниотомии малого костного окна. Кроме того, мы провели гистологические исследования и поведенческие оценки, чтобы всесторонне охарактеризовать ишемические повреждения и исходы инсульта в этой экспериментальной модели. Мы стремимся познакомить исследователей с этой моделью и способствовать дальнейшим исследованиям патологических механизмов ишемического инсульта.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем протоколе краниотомической модели электрокоагуляции dMCAO хирургические процедуры проводятся с минимальной инвазивностью, при этом отделяется только часть височной мышцы для смягчения неблагоприятного воздействия на жевательную функцию. Все мыши хорошо восстановились по…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Фонда естественных наук провинции Хубэй (2022CFC057).
Materials
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) |
Sigma-Aldrich | 108380 | Dye for TTC staining |
| 24-well culture plate | Corning (USA) | CLS3527 | Vessel for TTC staining |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1101 | Tissue fixation |
| 5% bovine serum albumin | Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd. | AR004 | Non-specific antigen blocking |
| 5-0 Polyglycolic acid suture | Jinhuan Medical Co., Ltd | KCR531 | Material for surgery |
| Anesthesia machine | Midmark Corporation | VMR | Anesthetized animal |
| Antifade mounting medium | Beyotime Biotech | P0131 | Seal for IF staining |
| Automation-tissue-dehydrating machine |
Leica Biosystems (Germany) | TP1020 | Dehydrate tissue |
| Depilatory cream | Veet (France) | 20220328 | Material for surgery |
| Diclofenac sodium gel | Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical Co., Ltd. |
H10950214 | Analgesia for animal |
| Drill tip (0.8 mm) | Rwd Life Science Co., Ltd. | Equipment for surgery | |
| Eosin staining solution | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1001 | Dye for H&E staining |
| Eye ointment | Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd | H44023098 | Material for surgery |
| Fluorescence microscope | Olympus (Japan) | BX51 | Image acquisition |
| GFAP Mouse monoclonal antibody | Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
3670 | Primary antibody for IF staining |
| Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG |
Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
4408 | Second antibody for IF staining |
| Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG |
Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
8889 | Second antibody for IF staining |
| Grip strength meter | Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd. | XR501 | Equipment for behavioral test |
| Hematoxylin staining solution | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1004 | Dye for H&E staining |
| Iba1 Rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab178846 | Primary antibody for IF staining |
| Isoflurane | Rwd Life Science Co., Ltd. | R510-22-10 | Anesthetized animal |
| Laser doppler blood flow meter | Moor Instruments (UK) | moorVMS | Blood flow monitoring |
| Meloxicam | Boehringer-Ingelheim | J20160020 | Analgesia for animal |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd. | 78001 | Equipment for surgery |
| Microsurgical instruments set | Rwd Life Science Co., Ltd. | SP0009-R | Equipment for surgery |
| Microtome | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Tissue section production |
| Microtome blade | Leica Biosystems (Germany) | 819 | Tissue section production |
| Monopolar electrocoagulation generator | Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd. |
CZ0001 | Equipment for surgery |
| Mupirocin ointment | Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd. |
H10930064 | Anti-infection for animal |
| NeuN Rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
24307 | Primary antibody for IF staining |
| Neutral balsam | Absin Bioscience | abs9177 | Seal for H&E staining |
| Paraffin embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | Euthanized animal |
| Phosphate buffered saline | Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd | C0221A | Rinsing for tissue section |
| Shaver | Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd. |
CP-9200 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution | Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd. | P0083 | Antigen retrieval for IF staining |
References
- Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC Focus Seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
- GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2019).
- Joo, H., Wang, G., George, M. G. A literature review of cost-effectiveness of intravenous recombinant tissue plasminogen activator for treating acute ischemic stroke. Stroke Vasc Neurol. 2 (2), 73-83 (2017).
- Jones, A. T., O’Connell, N. K., David, A. S. Epidemiology of functional stroke mimic patients: a systematic review and meta-analysis. Eur J Neurol. 27 (1), 18-26 (2020).
- Tamura, A., et al. Focal cerebral ischaemia in the rat: Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Candelario-Jalil, E., Paul, S. Impact of aging and comorbidities on ischemic stroke outcomes in preclinical animal models: A translational perspective. J Exp Neurol. 335, 113494 (2021).
- Zuo, X., et al. Attenuation of secondary damage and Aβ deposits in the ipsilateral thalamus of dMCAO rats through reduction of cathepsin B by bis(propyl)-cognitin, a multifunctional dimer. Neuropharmacology. 162, 107786 (2020).
- Shabani, Z., Farhoudi, M., Rahbarghazi, R., Karimipour, M., Mehrad, H. Cellular, histological, and behavioral pathological alterations associated with the mouse model of photothrombotic ischemic stroke. J Chem Neuroanat. 130, 102261 (2023).
- Caleo, M. Rehabilitation and plasticity following stroke: Insights from rodent models. Neuroscience. 311, 180-194 (2015).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. J Vis Exp. (89), e51729 (2014).
- Lavayen, B. P., et al. Neuroprotection by the cannabidiol aminoquinone VCE-004.8 in experimental ischemic stroke in mice. Neurochem Int. 165, 105508 (2023).
- Hu, K., et al. Cathepsin B knockout confers significant brain protection in the mouse model of stroke. J Exp Neurol. 368, 114499 (2023).
- Yu, S. P., et al. Optochemogenetic stimulation of transplanted iPS-NPCs enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. J Neurosci. 39 (33), 6571-6594 (2019).
- Lin, Y. H., et al. Opening a new time window for treatment of stroke by targeting HDAC2. J Neurosci. 37 (28), 6712-6728 (2017).
- Shi, X. F., Ai, H., Lu, W., Cai, F. SAT: Free software for the semi-automated analysis of rodent brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining. Front Neurosci. 13, 102 (2019).
- Jensen, E. C., et al. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat Rec. 296 (3), 378-381 (2013).
- Donahue, J., Wintermark, M. Perfusion CT and acute stroke imaging: foundations, applications, and literature review. J Neuroradiol. 42 (1), 21-29 (2015).
- Sun, M., et al. Long-term L-3-n-butylphthalide pretreatment attenuates ischemic brain injury in mice with permanent distal middle cerebral artery occlusion through the Nrf2 pathway. Heliyon. 8 (7), e09909 (2022).
- Balkaya, M. G., Trueman, R. C., Boltze, J., Corbett, D., Jolkkonen, J. Behavioral outcome measures to improve experimental stroke research. Behav Brain Res. 352, 161-171 (2018).
- Hao, T., et al. Inflammatory mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury with treatment of stepharine in rats. Phytomedicine. 79, 153353 (2020).
- Pietrogrande, G., et al. Low oxygen post conditioning prevents thalamic secondary neuronal loss caused by excitotoxicity after cortical stroke. Sci Rep. 9 (1), 4841 (2019).
- Shi, X., et al. Stroke subtype-dependent synapse elimination by reactive gliosis in mice. Nat Commun. 12 (1), 6943 (2021).
- Chen, W. C., et al. Aryl hydrocarbon receptor modulates stroke-induced astrogliosis and neurogenesis in the adult mouse brain. JNeuroinflammation. 16 (1), 187 (2019).
