Summary

Induction de l’AVC ischémique aigu chez la souris à l’aide de la technique d’occlusion de l’artère moyenne distale

Published: December 15, 2023
doi:

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour établir un modèle distal d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (dMCAO) par électrocoagulation transcrânienne chez les souris C57BL/6J et évaluons le comportement neurologique et les caractéristiques histopathologiques ultérieurs.

Abstract

L’AVC ischémique reste la principale cause de mortalité et de déficience fonctionnelle parmi les populations adultes à l’échelle mondiale. Seule une minorité de patients victimes d’un AVC ischémique sont éligibles pour recevoir une thrombolyse intravasculaire ou une thrombectomie mécanique dans la fenêtre de temps optimale. Parmi ces survivants d’AVC, environ deux tiers souffrent de dysfonctionnements neurologiques sur une période prolongée. L’établissement d’un modèle expérimental stable et reproductible de l’AVC ischémique est extrêmement important pour approfondir l’étude des mécanismes physiopathologiques et développer des stratégies thérapeutiques efficaces pour l’AVC ischémique. L’artère cérébrale moyenne (ACM) représente l’emplacement prédominant de l’AVC ischémique chez l’homme, l’occlusion de l’ACM servant de modèle fréquemment utilisé de l’ischémie cérébrale focale. Dans ce protocole, nous décrivons la méthodologie d’établissement du modèle d’occlusion distale de MCA (dMCAO) par électrocoagulation transcrânienne chez les souris C57BL/6. Étant donné que le site d’occlusion est situé au niveau de la branche corticale de l’ACM, ce modèle génère une lésion infarctus modérée limitée au cortex. La caractérisation neurologique, comportementale et histopathologique a mis en évidence un dysfonctionnement moteur visible, une dégénérescence neuronale et une activation prononcée de la microglie et des astrocytes dans ce modèle. Ainsi, ce modèle de souris dMCAO fournit un outil précieux pour étudier l’ischémie, l’AVC et la valeur de la popularisation.

Introduction

L’accident vasculaire cérébral est une maladie cérébrovasculaire aiguë fréquente caractérisée par une incidence élevée d’invalidité et de mortalité1. Sur l’ensemble des cas d’AVC, près de 80 % appartiennent à l’AVC ischémique2. Jusqu’à présent, la thrombolyse intraveineuse reste l’une des rares approches productives pour le traitement de l’AVC ischémique aigu. Cependant, l’efficacité du traitement thrombolytique est limitée par la fenêtre temporelle efficace étroite et la survenue d’une transformation hémorragique3. Dans la phase de rééducation à long terme après un AVC ischémique, un nombre considérable de patients sont susceptibles de présenter des dysfonctionnements neurologiques durables4. Des recherches plus approfondies sont nécessaires de toute urgence pour démêler les mécanismes physiopathologiques sous-jacents de l’AVC ischémique, ainsi que pour faciliter le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’AVC ischémique. L’établissement d’un modèle fiable et reproductible de l’AVC ischémique est crucial pour la recherche fondamentale ainsi que pour la recherche translationnelle ultérieure dans le domaine de l’AVC ischémique.

En 1981, Tamura et al. ont développé un modèle d’ischémie cérébrale focale en utilisant l’électrocoagulation transcrânienne au site proximal de l’artère cérébrale moyenne (ACM)5. Depuis lors, de nombreux chercheurs ont utilisé diverses méthodologies telles que la ligature, la compression ou le clipping pour induire une occlusion distale de MCA (dMCAO) pour établir des modèles d’AVC ischémique transitoire ou permanent 6,7,8. Par rapport au modèle de filament, le modèle dMCAO présente des avantages notables tels qu’une taille d’infarctus plus petite et un taux de survie plus élevé, ce qui le rend plus adapté à l’étude de la récupération fonctionnelle à long terme après un AVC ischémique9. De plus, le modèle dMCAO démontre un taux de survie plus élevé chez les rongeurs âgés par rapport au modèle à filament, ce qui en fait un outil avantageux pour l’étude de l’AVC ischémique chez les personnes âgées et les modèles animaux comorbides10. Il a été démontré que le modèle d’AVC photothrombotique (PT) possède les caractéristiques d’une intervention chirurgicale moins invasive et d’un taux de mortalité significativement faible. Cependant, le modèle PT présente un degré plus élevé de nécrose cellulaire et d’œdème tissulaire par rapport au modèle dMCAO, conduisant à l’absence de circulation collatérale11. De plus, il convient de noter que les lésions ischémiques observées dans le modèle PT résultent principalement d’une occlusion microvasculaire, qui diffère considérablement de l’ischémie cérébrale induite par l’embolie des gros vaisseaux dans le modèle dMCAO12.

Dans cet article, nous présentons la méthodologie permettant d’induire le modèle murin dMCAO en coagulant le MCA distal via une craniotomie à fenêtre osseuse. De plus, nous avons effectué des examens histologiques et des évaluations comportementales pour caractériser de manière exhaustive les agressions ischémiques et les résultats des accidents vasculaires cérébraux dans ce modèle expérimental. Notre objectif est de familiariser les chercheurs avec ce modèle et de faciliter d’autres recherches sur les mécanismes pathologiques de l’AVC ischémique.

Protocol

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Jianghan et a été mené conformément aux directives éthiques sur les animaux de laboratoire publiées par le Centre de contrôle des maladies de Chine. Des souris C57BL/6J mâles adultes, âgées de 10 semaines, pesant de 24 à 26 g, ont été utilisées dans ce protocole. Toutes les souris ont été logées dans un environnement contrôlé par un cycle lumière/obscurité de 12 heures avec de la nourriture et de l’eau à volonté. 1. Préparation préopératoire REMARQUE : Les principaux instruments et équipements requis pour ce protocole sont illustrés à la figure 1. Avant l’intervention, stérilisez les instruments chirurgicaux par autoclavage. Administrer le méloxicam par voie sous-cutanée à une dose de 5 mg/kg pour l’analgésie 60 minutes avant la chirurgie. Anesthésie la souris avec de l’isoflurane à 5 % dans une chambre d’induction. Essuyez la planche de chirurgie chauffante avec de l’éthanol à 75 % et activez l’interrupteur de chauffage avec la température réglée sur 37 °C. Ensuite, positionnez la souris en position latérale gauche sur la planche, la tête positionnée à l’opposé du chirurgien et la queue tournée vers le chirurgien. Fixez un masque sur le visage de la souris qui fournit un apport constant de 2 % d’isoflurane et de 0,3 L/min d’oxygène pour l’anesthésie d’entretien. Appliquez la pommade oculaire sur la cornée pour la protéger du dessèchement pendant la procédure. Rasez la fourrure de l’orbite gauche au conduit auditif gauche avec un rasoir. Utilisez des crèmes dépilatoires pour enlever la fourrure restante pour la stérilisation. Préparez la zone chirurgicale en appliquant trois fois un désinfectant à base de povidone iodé et d’éthanol à 75 %. 2. Modèle MCAO distal Vérifiez si la souris est profondément anesthésiée en évaluant les réflexes du pincement de l’orteil. Faites une incision verticale entre l’orbite gauche et le conduit auditif gauche à l’aide d’une lame de scalpel stérile. Rétractez les tissus mous de la peau à l’aide d’écarteurs et exposez le muscle temporal. Utilisez des micropinces droites pour séparer les segments apical et dorsal du muscle temporal du crâne. Identifiez la bifurcation de l’ACM, qui prend une forme en « Y » sous l’os temporal avec un biais vers la base du crâne (Figure 2A).REMARQUE : Si la bifurcation de MCA n’est pas visuellement discernable (en raison d’une variation anatomiquement normale), déterminez le vaisseau le plus rostral. À l’aide d’une perceuse crânienne électrique, amincissez le crâne pour en faire une fenêtre osseuse (4 mm de diamètre) jusqu’à ce que la dure-mère, avec sa texture translucide, devienne visible.REMARQUE : Ajoutez par intermittence des gouttes de solution saline normale sur le crâne pour éviter la surchauffe pendant ce processus. Retirez la dure-mère au-dessus de l’artère à l’aide d’une micro-pince incurvée pour exposer la branche MCA. Réglez l’électrocautérisation à 7 W. Coagulez l’artère à l’aide de la pince de coagulation électrique aux sites proximaux et distaux de la bifurcation de l’ACM (Figure 2A). Lorsque la bifurcation n’est pas visible en raison d’une variation anatomique, effectuez la coagulation sur la branche MCA identifiée avec précision (comme mentionné ci-dessus) à deux endroitsdistincts à environ 1 mm de distance. Surveillez le flux sanguin de la branche corticale gauche du MCA à l’aide d’un débitmètre sanguin à moucheture laser.REMARQUE : Les souris présentant une réduction du débit sanguin inférieure à 40 % de la valeur de base après l’électrocoagulation ont été exclues de l’étude. Suturez le muscle et la peau séparément à l’aide de sutures à l’acide polyglycolique 5-0. Appliquez du gel de diclofénac sodique et de la pommade à la mupirocine sur l’incision cutanée à l’aide d’un coton-tige stérile. Placez la souris dans une chambre de récupération. Surveillez toutes les souris jusqu’à ce qu’elles soient complètement réveillées. Fournir du méloxicam (5 mg/kg, SC) pour l’analgésie toutes les 24 h jusqu’à 72 h. 3. Opération fictive Reproduire la même procédure que celles mentionnées ci-dessus, à l’exclusion du processus de coagulation artérielle. 4. Tests comportementaux REMARQUE : Avant le dMCAO, les souris ont subi un entraînement comportemental deux fois par jour pendant 3 jours. Le 3èmejour après le dMCAO, déplacez les souris dans la salle de test comportemental pour une adaptation environnementale de 2 heures avant le test. Test de force de préhension14REMARQUE : Le compteur de force de préhension comprend une jauge de contrainte push-pull et une barre horizontale métallique.Saisissez la base de la queue de la souris. Abaissez progressivement la souris vers la barre de préhension métallique jusqu’à ce qu’elle saisisse la barre horizontale avec les deux pattes avant (Figure 2B). Tirez la souris vers l’arrière à une vitesse constante d’environ 2 cm/s et maintenez son corps à l’horizontale. Enregistrez la force maximale en grammes (g) lorsque la souris relâche ses pattes avant de la barre. Essai de pôle15Placez la souris au sommet d’un poteau vertical en bois (50 cm de haut, 1 cm de diamètre), la tête tournée vers le haut, et laissez-la descendre du poteau (Figure 2B). Notez le temps mis par la souris pour faire demi-tour (T-turn) et le temps total pour descendre du poteau (T-total) avec un temps de coupure de 60 s. Test de retrait du ruban adhésif16Tenez la souris et fixez un morceau de ruban adhésif (2 × 2 mm) sur la patte avant droite de la souris (Figure 2B). Remettez la souris dans la cage d’élevage et laissez-la se déplacer librement. Enregistrez le temps nécessaire à la souris pour enlever l’adhésif avec une limite de 60 s. Essai de cylindre17Placez la souris dans un cylindre en verre transparent ouvert (diamètre : 14 cm ; hauteur : 20 cm) et enregistrez son comportement d’exploration spontané debout pendant 3 minutes à l’aide d’une caméra (Figure 2B).REMARQUE : Au cours de la procédure expérimentale, deux miroirs ont été positionnés le long du cylindre pour assurer un enregistrement optimal des mouvements des membres antérieurs. Essuyez le cylindre avec de l’éthanol à 75 % pour éliminer les signaux olfactifs résiduels avant de tester la souris suivante. Réduisez la vitesse de lecture de la vidéo à 1/5 de la vitesse réelle et comptez le nombre de touches murales avec la patte avant gauche (L) ou droite (R) ou l’utilisation simultanée des deux pattes avant (B). Calculez le taux d’utilisation de la patte avant droite comme suit : (L-R)/(L + R + B) × 100 %. 5. Perfusion et préparation des échantillons Euthanasier la souris par injection péritonéale : surdosage de pentobarbital (300 mg/kg). Positionnez la souris en position couchée et immobilisez les membres. Faites une incision médiane sur la peau, en partant de la cavité abdominale médiane et en s’étendant vers la région supérieure de la poitrine. Ouvrez la poitrine à l’aide de ciseaux chirurgicaux et pliez le xiphoïde vers le haut à l’aide d’un hémostat. Retirez soigneusement le poumon et le diaphragme pour exposer le cœur. Insérez l’extrémité de l’aiguille de perfusion dans le ventricule gauche et percez l’oreillette droite avec des ciseaux. Perfuser le cœur avec 20 ml de solution saline normale par le ventricule gauche. Décapitez la souris et ouvrez le cuir chevelu le long de la ligne médiane entre les yeux. Coupez l’os des deux côtés, en partant de la base du crâne et en s’ouvrant jusqu’à l’orbite. Soulevez le calvarium et détachez doucement le cerveau de la base du crâne à l’aide d’une pince.REMARQUE : Les cerveaux de la moitié des souris ont été soumis à une coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC), tandis que les cerveaux de l’autre moitié ont fait l’objet d’un examen histologique. Faites tremper les cerveaux dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit pour une analyse histologique de suivi. 6. Identification du volume de l’infarctus Placez le cerveau dans un compartiment congélateur à -20 °C du réfrigérateur pendant 20 min. Positionnez le cerveau dans la matrice cérébrale de 1 mm et coupez le cerveau en sections coronaires d’une épaisseur de 2 mm à l’aide de lames de microtome. Transférez les sections cérébrales dans une plaque de culture à 24 puits et ajoutez 2 % de TTC pour couvrir le tissu cérébral. Mettez la plaque de culture à 24 puits dans un four à température constante pendant 30 min avec la température réglée à 37 °C. Soulevez soigneusement les sections du cerveau et fixez-les dans une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min. Effectuez un balayage optique de ces sections cérébrales avec une résolution de 1200 x 1200 dpi par un scanister. Mesurez le volume de l’infarctus cérébral en additionnant la zone de l’infarctus de chaque section (aire de l’hémisphère droit moins zone non blessée de l’hémisphère gauche) à l’aide du logiciel Image J (https://imagej.net/software/imagej/index)18. Calculez le pourcentage de volume d’infarctus comme volume d’infarctus/volume de l’hémisphère droit × 100%. 7. Analyse histopathologique et de coloration immunofluorescente Prélevez les échantillons de cerveau de la solution de paraformaldéhyde et rincez-les à l’eau courante pendant 1 h. Transférez les échantillons de cerveau dans la machine automatisée de déshydratation des tissus. Lancez le programme prédéfini pour la déshydratation, la vitrification et l’immersion dans la cire. Incorporez les échantillons de cerveau déshydraté dans de la paraffine et coupez-les en sections de 5 m d’épaisseur à l’aide d’un microtome. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)Dépiaffinez les sections avec du xylène 3 fois pendant 8 minutes chacune. Réhydrater les sections en les immergeant successivement dans de l’éthanol à gradient (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) et de l’eau distillée pendant 5 min à chaque fois. Colorer les sections avec la solution d’hématoxyline pendant 5 min. Rincez les sections à l’eau distillée pour laver les résidus d’hématoxyline, puis trempez-les dans de l’alcool à 5% d’acide chlorhydrique pour une différenciation 5-s. Lavez les sections à l’eau distillée pendant 2 min. Teindre les sections avec une solution d’éosine pendant 30 secondes et rincer l’excès de liquide colorant à l’eau distillée. Immergez les sections dans 90% d’éthanol, 95% d’éthanol, 100% d’éthanol et xylène (2 fois) successivement pendant 5 min à chaque fois. Montez les sections avec un support de montage neutre pour baume. Coloration par immunofluorescenceDaffinez les sections avec du xylène 3 fois pendant 8 min à chaque fois. Réhydratez les sections en les immergeant successivement dans de l’éthanol dégradé (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) et de l’eau distillée pendant 5 min à chaque fois. Préchauffez la solution de récupération de l’antigène citrate à ébullition au micro-ondes. Immergez les sections dans la solution de récupération de l’antigène. Réchauffez le tampon de récupération d’antigène à faible puissance (20 W) pendant 20 min. Éteignez le micro-ondes et laissez le tampon de récupération d’antigène refroidir à température ambiante (RT). Lavez les sections trois fois avec 0,1 mM de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 minutes à chaque fois. Incuber les sections avec une solution bloquante (5 % d’albumine sérique bovine) à la RT pendant 1 h pour bloquer la liaison non spécifique de l’immunoglobuline. Incuber les sections avec de l’anticorps anti-NeuN de lapin (1:300), de l’anticorps anti-Iba-1 de lapin (1:500) et de l’anticorps anti-GFAP de souris (1:500) à 4°C pendant la nuit. Lavez les sections trois fois avec 0,1 mM PBS pendant 5 minutes à chaque fois. Incuber les sections avec des IgG conjuguées Alexa 594 anti-lapin (1:500) ou des IgG conjuguées Alexa 488 (1:500) pendant 1 h à RT. Lavez les sections avec 0,1 mM de PBS et montez-les avec un support de montage anti-décoloration contenant du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Prenez des images de trois champs microscopiques (300 μm × 300 μm) à l’intérieur de la pénombre ischémique à l’aide d’un microscope fluorescent à 594 nm et 488 nm, respectivement. À l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.net/software/imagej/index), estimez la densité cellulaire colorée positivement en faisant la moyenne du nombre de cellules dans la pénombre ischémique19.

Representative Results

Les principaux instruments utilisés pour effectuer le dMCAO sont l’ensemble d’instruments microchirurgicaux, le vaporisateur d’isoflurane et le générateur d’électrocoagulation microchirurgicale monopolaire illustré à la figure 1. La procédure expérimentale de cette étude est illustrée à la figure 2. En bref, une petite craniotomie osseuse a été utilisée pour exposer le MCA distal, qui a ensuite été coagulé pour induire une ischémie cé…

Discussion

Dans le protocole actuel du modèle dMCAO d’électrocoagulation par craniotomie, les interventions chirurgicales sont menées avec un minimum d’invasivité, dans lequel seule une partie du muscle temporal est séparée pour atténuer les effets indésirables sur la fonction masticatoire. Les souris se sont toutes bien rétablies après la procédure, sans qu’aucun cas de difficultés d’alimentation n’ait été observé. L’ACM peut être facilement discernée dans l’os temporal de la souris, facilitant ainsi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par les subventions de la Nature Science Foundation de la province du Hubei (2022CFC057).

Materials

2,3,5-Triphenyltetrazolium
Chloride (TTC)
Sigma-Aldrich 108380 Dye for TTC staining
24-well culture plate Corning (USA) CLS3527 Vessel for TTC staining
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.
G1101 Tissue fixation
5% bovine serum albumin Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd. AR004 Non-specific antigen blocking
5-0 Polyglycolic acid suture Jinhuan Medical Co., Ltd KCR531 Material for surgery
Anesthesia machine Midmark Corporation VMR Anesthetized animal
Antifade mounting medium Beyotime Biotech P0131 Seal for IF staining
Automation-tissue-dehydrating 
machine
Leica Biosystems (Germany) TP1020 Dehydrate tissue
Depilatory cream Veet (France) 20220328 Material for surgery
Diclofenac sodium gel Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical
 Co., Ltd.
H10950214 Analgesia for animal
Drill tip (0.8 mm) Rwd Life Science Co., Ltd. Equipment for surgery
Eosin staining solution Wuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.
G1001 Dye for H&E staining
Eye ointment Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd H44023098 Material for surgery
Fluorescence microscope Olympus (Japan) BX51 Image acquisition
GFAP Mouse monoclonal antibody Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)
3670 Primary antibody for IF staining
Goat anti-mouse Alexa
488-conjugated IgG
Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)
4408 Second antibody for IF staining
Goat anti-rabbit Alexa
594-conjugated IgG
Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)
8889 Second antibody for IF staining
Grip strength meter Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd. XR501 Equipment for behavioral test
Hematoxylin staining solution Wuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.
G1004 Dye for H&E staining
Iba1 Rabbit monoclonal antibody Abcam ab178846 Primary antibody for IF staining
Isoflurane Rwd Life Science Co., Ltd. R510-22-10 Anesthetized animal
Laser doppler blood flow meter Moor Instruments (UK) moorVMS Blood flow monitoring
Meloxicam Boehringer-Ingelheim J20160020 Analgesia for animal
Microdrill Rwd Life Science Co., Ltd. 78001 Equipment for surgery
Microsurgical instruments set Rwd Life Science Co., Ltd. SP0009-R Equipment for surgery
Microtome Thermo Fisher Scientific (USA) HM325 Tissue section production
Microtome blade Leica Biosystems (Germany) 819 Tissue section production
Monopolar electrocoagulation generator Spring Scenery Medical Instrument
Co., Ltd.
CZ0001 Equipment for surgery
Mupirocin ointment Tianjin Smith Kline & French
Laboratories Ltd.
H10930064 Anti-infection for animal
NeuN Rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)
24307 Primary antibody for IF staining
Neutral balsam Absin Bioscience abs9177 Seal for H&E staining
Paraffin embedding center Thermo Fisher Scientific (USA) EC 350 Produce paraffin blocks
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P3761 Euthanized animal
Phosphate buffered saline Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd C0221A Rinsing for tissue section
Shaver Shenzhen Codos Electrical Appliances
Co.,Ltd.
CP-9200 Equipment for surgery
Sodium citrate solution Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd. P0083 Antigen retrieval for IF staining

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Citer Cet Article
Leng, C., Li, Y., Sun, Y., Liu, W. Induction of Acute Ischemic Stroke in Mice Using the Distal Middle Artery Occlusion Technique. J. Vis. Exp. (202), e66134, doi:10.3791/66134 (2023).

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