تحريض السكتة الدماغية الحادة في الفئران باستخدام تقنية انسداد الشريان الأوسط البعيد
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط البعيد (dMCAO) من خلال التخثير الكهربائي عبر الجمجمة في الفئران C57BL / 6J وتقييم السلوك العصبي اللاحق والسمات النسيجية.
Abstract
لا تزال السكتة الدماغية الإقفارية السبب السائد للوفيات والضعف الوظيفي بين السكان البالغين على مستوى العالم. فقط أقلية من مرضى السكتة الدماغية الإقفارية مؤهلون لتلقي انحلال الخثرة داخل الأوعية أو علاج استئصال الخثرة الميكانيكية خلال النافذة الزمنية المثلى. من بين هؤلاء الناجين من السكتة الدماغية ، يعاني حوالي الثلثين من اختلالات عصبية على مدى فترة طويلة. يعد إنشاء نموذج تجريبي مستقر وقابل للتكرار للسكتة الدماغية أمرا في غاية الأهمية لمزيد من التحقيق في الآليات الفيزيولوجية المرضية وتطوير استراتيجيات علاجية فعالة للسكتة الدماغية. يمثل الشريان الدماغي الأوسط (MCA) الموقع السائد للسكتة الدماغية الإقفارية لدى البشر ، حيث يعمل انسداد MCA كنموذج يستخدم بشكل متكرر لنقص التروية الدماغية البؤري. في هذا البروتوكول ، نصف منهجية إنشاء نموذج انسداد MCA البعيد (dMCAO) من خلال التخثير الكهربائي عبر الجمجمة في الفئران C57BL / 6. نظرا لأن موقع الانسداد يقع في الفرع القشري من MCA ، فإن هذا النموذج يولد آفة احتشاء معتدلة تقتصر على القشرة. أظهر التوصيف السلوكي العصبي والنسيجي المرضي خللا وظيفيا حركيا مرئيا ، وتنكس الخلايا العصبية ، وتنشيطا واضحا للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية في هذا النموذج. وبالتالي ، يوفر نموذج الماوس dMCAO هذا أداة قيمة للتحقيق في السكتة الدماغية وقيمة التعميم.
Introduction
السكتة الدماغية هي مرض دماغي وعائي حاد شائع يتميز بارتفاع حالات الإعاقة والوفيات1. من بين جميع حالات السكتة الدماغية ، ينتمي ما يقرب من 80٪ إلى السكتة الدماغية2. حتى الآن ، لا يزال انحلال الخثرة في الوريد واحدا من عدد محدود من الأساليب الإنتاجية لعلاج السكتة الدماغية الحادة. ومع ذلك ، فإن فعالية العلاج بالتخثر مقيدة بالنافذة الزمنية الفعالة الضيقة وحدوث التحول النزفي3. في مرحلة إعادة التأهيل على المدى الطويل بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، من المحتمل أن يعاني عدد كبير من المرضى من اختلالات عصبية دائمة4. هناك حاجة ماسة إلى مزيد من التحقيق لكشف الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء السكتة الدماغية الإقفارية ، وكذلك لتسهيل تطوير استراتيجيات علاجية جديدة تستهدف السكتة الدماغية. يعد إنشاء نموذج يمكن الاعتماد عليه وقابل للتكرار للسكتة الدماغية أمرا بالغ الأهمية للبحث الأساسي بالإضافة إلى الأبحاث الانتقالية اللاحقة في مجال السكتة الدماغية.
في عام 1981 ، طور Tamura et al. نموذجا لنقص التروية الدماغية البؤري من خلال استخدام التخثير الكهربائي عبر الجمجمة في الموقع القريب للشريان الدماغي الأوسط (MCA) 5. منذ ذلك الحين ، استخدم العديد من الباحثين منهجيات مختلفة مثل الربط أو الضغط أو القص للحث على انسداد MCA البعيد (dMCAO) لإنشاء نماذج السكتة الدماغية العابرة أو الدائمة6،7،8. بالمقارنة مع نموذج الفتيل ، يظهر نموذج dMCAO مزايا ملحوظة مثل حجم الاحتشاء الأصغر ومعدل البقاء على قيد الحياة الأعلى ، مما يجعله أكثر ملاءمة للتحقيق في الانتعاش الوظيفي على المدى الطويل بعد السكتة الدماغية9. بالإضافة إلى ذلك ، يوضح نموذج dMCAO معدل بقاء أعلى في القوارض المسنة مقارنة بنموذج الخيوط ، مما يجعله أداة مفيدة للتحقيق في السكتة الدماغية في نماذج المسنة والمرضية10. وقد ثبت أن نموذج السكتة الدماغية الضوئية (PT) يمتلك خصائص غزو جراحي أقل ومعدل وفيات منخفض بشكل ملحوظ. ومع ذلك ، يظهر نموذج PT درجة أكبر من النخر الخلوي وذمة الأنسجة مقارنة بنموذج dMCAO ، مما يؤدي إلى عدم وجود دوران جانبي11. علاوة على ذلك ، من الجدير بالذكر أن الآفات الإقفارية التي لوحظت في نموذج PT تنشأ في الغالب من انسداد الأوعية الدموية الدقيقة ، والذي يختلف اختلافا كبيرا عن نقص التروية الدماغية الناجم عن انسداد الأوعية الدموية الكبيرة في نموذج dMCAO12.
في هذه الورقة ، نقدم منهجية لتحفيز نموذج dMCAO الفئران عن طريق تخثر MCA البعيد عن طريق حج القحف لنافذة عظمية صغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا فحوصات نسيجية وتقييمات سلوكية لتوصيف شامل للإهانات الإقفارية ونتائج السكتة الدماغية في هذا النموذج التجريبي. نهدف إلى تعريف الباحثين بهذا النموذج وتسهيل إجراء مزيد من التحقيقات في الآليات المرضية للسكتة الدماغية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في البروتوكول الحالي لنموذج dMCAO لحج القحف الكهربائي ، يتم إجراء العمليات الجراحية بأقل قدر من الغزو ، حيث يتم فصل جزء فقط من العضلة الصدغية للتخفيف من الآثار الضارة على وظيفة المضغ. تعافت جميع الفئران بشكل جيد بعد العملية ، مع عدم وجود حالات ملحوظة من صعوبات التغذية. يمكن تمييز MCA بسهولة في …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من خلال المنح المقدمة من مؤسسة علوم الطبيعة في مقاطعة هوبي (2022CFC057).
Materials
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) |
Sigma-Aldrich | 108380 | Dye for TTC staining |
| 24-well culture plate | Corning (USA) | CLS3527 | Vessel for TTC staining |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1101 | Tissue fixation |
| 5% bovine serum albumin | Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd. | AR004 | Non-specific antigen blocking |
| 5-0 Polyglycolic acid suture | Jinhuan Medical Co., Ltd | KCR531 | Material for surgery |
| Anesthesia machine | Midmark Corporation | VMR | Anesthetized animal |
| Antifade mounting medium | Beyotime Biotech | P0131 | Seal for IF staining |
| Automation-tissue-dehydrating machine |
Leica Biosystems (Germany) | TP1020 | Dehydrate tissue |
| Depilatory cream | Veet (France) | 20220328 | Material for surgery |
| Diclofenac sodium gel | Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical Co., Ltd. |
H10950214 | Analgesia for animal |
| Drill tip (0.8 mm) | Rwd Life Science Co., Ltd. | Equipment for surgery | |
| Eosin staining solution | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1001 | Dye for H&E staining |
| Eye ointment | Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd | H44023098 | Material for surgery |
| Fluorescence microscope | Olympus (Japan) | BX51 | Image acquisition |
| GFAP Mouse monoclonal antibody | Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
3670 | Primary antibody for IF staining |
| Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG |
Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
4408 | Second antibody for IF staining |
| Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG |
Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
8889 | Second antibody for IF staining |
| Grip strength meter | Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd. | XR501 | Equipment for behavioral test |
| Hematoxylin staining solution | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1004 | Dye for H&E staining |
| Iba1 Rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab178846 | Primary antibody for IF staining |
| Isoflurane | Rwd Life Science Co., Ltd. | R510-22-10 | Anesthetized animal |
| Laser doppler blood flow meter | Moor Instruments (UK) | moorVMS | Blood flow monitoring |
| Meloxicam | Boehringer-Ingelheim | J20160020 | Analgesia for animal |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd. | 78001 | Equipment for surgery |
| Microsurgical instruments set | Rwd Life Science Co., Ltd. | SP0009-R | Equipment for surgery |
| Microtome | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Tissue section production |
| Microtome blade | Leica Biosystems (Germany) | 819 | Tissue section production |
| Monopolar electrocoagulation generator | Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd. |
CZ0001 | Equipment for surgery |
| Mupirocin ointment | Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd. |
H10930064 | Anti-infection for animal |
| NeuN Rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
24307 | Primary antibody for IF staining |
| Neutral balsam | Absin Bioscience | abs9177 | Seal for H&E staining |
| Paraffin embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | Euthanized animal |
| Phosphate buffered saline | Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd | C0221A | Rinsing for tissue section |
| Shaver | Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd. |
CP-9200 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution | Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd. | P0083 | Antigen retrieval for IF staining |
References
- Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC Focus Seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
- GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2019).
- Joo, H., Wang, G., George, M. G. A literature review of cost-effectiveness of intravenous recombinant tissue plasminogen activator for treating acute ischemic stroke. Stroke Vasc Neurol. 2 (2), 73-83 (2017).
- Jones, A. T., O’Connell, N. K., David, A. S. Epidemiology of functional stroke mimic patients: a systematic review and meta-analysis. Eur J Neurol. 27 (1), 18-26 (2020).
- Tamura, A., et al. Focal cerebral ischaemia in the rat: Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Candelario-Jalil, E., Paul, S. Impact of aging and comorbidities on ischemic stroke outcomes in preclinical animal models: A translational perspective. J Exp Neurol. 335, 113494 (2021).
- Zuo, X., et al. Attenuation of secondary damage and Aβ deposits in the ipsilateral thalamus of dMCAO rats through reduction of cathepsin B by bis(propyl)-cognitin, a multifunctional dimer. Neuropharmacology. 162, 107786 (2020).
- Shabani, Z., Farhoudi, M., Rahbarghazi, R., Karimipour, M., Mehrad, H. Cellular, histological, and behavioral pathological alterations associated with the mouse model of photothrombotic ischemic stroke. J Chem Neuroanat. 130, 102261 (2023).
- Caleo, M. Rehabilitation and plasticity following stroke: Insights from rodent models. Neuroscience. 311, 180-194 (2015).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. J Vis Exp. (89), e51729 (2014).
- Lavayen, B. P., et al. Neuroprotection by the cannabidiol aminoquinone VCE-004.8 in experimental ischemic stroke in mice. Neurochem Int. 165, 105508 (2023).
- Hu, K., et al. Cathepsin B knockout confers significant brain protection in the mouse model of stroke. J Exp Neurol. 368, 114499 (2023).
- Yu, S. P., et al. Optochemogenetic stimulation of transplanted iPS-NPCs enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. J Neurosci. 39 (33), 6571-6594 (2019).
- Lin, Y. H., et al. Opening a new time window for treatment of stroke by targeting HDAC2. J Neurosci. 37 (28), 6712-6728 (2017).
- Shi, X. F., Ai, H., Lu, W., Cai, F. SAT: Free software for the semi-automated analysis of rodent brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining. Front Neurosci. 13, 102 (2019).
- Jensen, E. C., et al. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat Rec. 296 (3), 378-381 (2013).
- Donahue, J., Wintermark, M. Perfusion CT and acute stroke imaging: foundations, applications, and literature review. J Neuroradiol. 42 (1), 21-29 (2015).
- Sun, M., et al. Long-term L-3-n-butylphthalide pretreatment attenuates ischemic brain injury in mice with permanent distal middle cerebral artery occlusion through the Nrf2 pathway. Heliyon. 8 (7), e09909 (2022).
- Balkaya, M. G., Trueman, R. C., Boltze, J., Corbett, D., Jolkkonen, J. Behavioral outcome measures to improve experimental stroke research. Behav Brain Res. 352, 161-171 (2018).
- Hao, T., et al. Inflammatory mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury with treatment of stepharine in rats. Phytomedicine. 79, 153353 (2020).
- Pietrogrande, G., et al. Low oxygen post conditioning prevents thalamic secondary neuronal loss caused by excitotoxicity after cortical stroke. Sci Rep. 9 (1), 4841 (2019).
- Shi, X., et al. Stroke subtype-dependent synapse elimination by reactive gliosis in mice. Nat Commun. 12 (1), 6943 (2021).
- Chen, W. C., et al. Aryl hydrocarbon receptor modulates stroke-induced astrogliosis and neurogenesis in the adult mouse brain. JNeuroinflammation. 16 (1), 187 (2019).
