Distal Orta Arter Oklüzyonu Tekniği Kullanılarak Farelerde Akut İskemik İnme İndüksiyonu
Summary
Burada, C57BL/6J farelerde transkraniyal elektrokoagülasyon yoluyla distal orta serebral arter tıkanıklığı (dMCAO) modeli oluşturmak ve sonraki nörolojik davranışları ve histopatolojik özellikleri değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
İskemik inme, tüm dünyada erişkin popülasyonlar arasında mortalite ve fonksiyonel bozukluğun baskın nedeni olmaya devam etmektedir. İskemik inme hastalarının sadece küçük bir kısmı en uygun zaman aralığında intravasküler tromboliz veya mekanik trombektomi tedavisi almaya uygundur. İnme geçirenler arasında, yaklaşık üçte ikisi uzun bir süre boyunca nörolojik işlev bozukluklarından muzdariptir. İskemik inme için patofizyolojik mekanizmaların daha fazla araştırılması ve etkili terapötik stratejilerin geliştirilmesi için stabil ve tekrarlanabilir bir deneysel iskemik inme modelinin oluşturulması son derece önemlidir. Orta serebral arter (MCA), insanlarda iskemik inmenin baskın lokalizasyonunu temsil eder ve MCA oklüzyonu, fokal serebral iskeminin sık kullanılan modeli olarak hizmet eder. Bu protokolde, C57BL/6 farelerde transkraniyal elektrokoagülasyon yoluyla distal MCA oklüzyonu (dMCAO) modelinin kurulması metodolojisini açıklıyoruz. Oklüzyon bölgesi MCA’nın kortikal dalında yer aldığından, bu model korteksle sınırlı orta derecede enfarktüslü bir lezyon oluşturur. Nörolojik davranışsal ve histopatolojik karakterizasyon, bu modelde görünür motor disfonksiyon, nöron dejenerasyonu ve mikroglia ve astrositlerin belirgin aktivasyonunu göstermiştir. Bu nedenle, bu dMCAO fare modeli, iskemi inmeyi ve popülerleşmenin değerini araştırmak için değerli bir araç sağlar.
Introduction
İnme, yüksek sakatlık ve mortalite insidansı ile karakterize yaygın bir akut serebrovasküler hastalıktır1. Tüm inme vakalarının yaklaşık %80’i iskemik inme2’ye aittir. Şimdiye kadar, intravenöz tromboliz, akut iskemik inme tedavisinde sınırlı sayıda üretken yaklaşımdan biri olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, trombolitik tedavinin etkinliği, dar etkili zaman penceresi ve hemorajik dönüşümün ortaya çıkması ile sınırlıdır3. İskemik inmeyi takiben uzun süreli rehabilitasyon aşamasında, önemli sayıda hastanın kalıcı nörolojik işlev bozuklukları yaşaması muhtemeldir4. İskemik inmenin altta yatan patofizyolojik mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve iskemik inmeyi hedefleyen yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırmak için acilen daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Güvenilir ve tekrarlanabilir bir iskemik inme modelinin oluşturulması, temel araştırmaların yanı sıra iskemik inme alanındaki müteakip translasyonel araştırmalar için çok önemlidir.
1981’de Tamura ve ark. orta serebral arterin (MCA) proksimal bölgesinde transkraniyal elektrokoagülasyon kullanarak bir fokal serebral iskemi modeli geliştirdi5. O zamandan beri, çok sayıda araştırmacı, geçici veya kalıcı iskemik inme modelleri oluşturmak için distal MCA oklüzyonunu (dMCAO) indüklemek için ligasyon, kompresyon veya kırpma gibi çeşitli metodolojiler kullanmıştır 6,7,8. Filament modeliyle karşılaştırıldığında, dMCAO modeli, daha küçük enfarktüs boyutu ve daha yüksek sağkalım oranı gibi dikkate değer avantajlar sergiler ve bu da onu iskemik inme9’u takiben uzun vadeli fonksiyonel iyileşmeyi araştırmak için daha uygun hale getirir. Ek olarak, dMCAO modeli, filament modeline kıyasla yaşlı kemirgenlerde daha yüksek bir hayatta kalma oranı gösterir, bu da onu yaşlı ve komorbid hayvan modellerinde iskemik inmeyi araştırmak için avantajlı bir araç haline getirir10. Fototrombotik (PT) inme modelinin daha az cerrahi invazivlik ve önemli ölçüde düşük mortalite oranı özelliklerine sahip olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, PT modeli, dMCAO modeline kıyasla daha fazla hücresel nekroz ve doku ödemi sergiler ve bu da kollateral dolaşımın olmamasına yol açar11. Ayrıca, PT modelinde gözlenen iskemik lezyonların ağırlıklı olarak mikrovasküler oklüzyondan kaynaklandığı ve dMCAO model12’deki büyük damar embolisinin neden olduğu serebral iskemiden önemli ölçüde farklı olduğu dikkat çekicidir.
Bu yazıda, küçük kemik penceresi kraniyotomi ile distal MCA’yı koagüle ederek murin dMCAO modelini indükleme metodolojisini sunuyoruz. Ek olarak, bu deneysel modelde iskemik hakaretleri ve inme sonuçlarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için histolojik incelemeler ve davranışsal değerlendirmeler yaptık. Amacımız, araştırmacıları bu model hakkında bilgilendirmek ve iskemik inmenin patolojik mekanizmaları hakkında daha fazla araştırma yapılmasını kolaylaştırmaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kraniyotomi elektrokoagülasyon dMCAO modelinin mevcut protokolünde, cerrahi prosedürler minimal invazivlik ile gerçekleştirilir, burada çiğneme fonksiyonu üzerindeki olumsuz etkileri azaltmak için temporalis kasının sadece bir kısmı ayrılır. Farelerin tümü işlemden sonra iyi bir şekilde iyileşti ve gözlemlenen herhangi bir beslenme güçlüğü vakası olmadı. MCA, farenin temporal kemiğinde kolayca ayırt edilebilir, böylece uygun kraniyotomi konumlarının hassas bir şekilde tanımlanmasını k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Hubei Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (2022CFC057) alınan Hibeler tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) |
Sigma-Aldrich | 108380 | Dye for TTC staining |
| 24-well culture plate | Corning (USA) | CLS3527 | Vessel for TTC staining |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1101 | Tissue fixation |
| 5% bovine serum albumin | Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd. | AR004 | Non-specific antigen blocking |
| 5-0 Polyglycolic acid suture | Jinhuan Medical Co., Ltd | KCR531 | Material for surgery |
| Anesthesia machine | Midmark Corporation | VMR | Anesthetized animal |
| Antifade mounting medium | Beyotime Biotech | P0131 | Seal for IF staining |
| Automation-tissue-dehydrating machine |
Leica Biosystems (Germany) | TP1020 | Dehydrate tissue |
| Depilatory cream | Veet (France) | 20220328 | Material for surgery |
| Diclofenac sodium gel | Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical Co., Ltd. |
H10950214 | Analgesia for animal |
| Drill tip (0.8 mm) | Rwd Life Science Co., Ltd. | Equipment for surgery | |
| Eosin staining solution | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1001 | Dye for H&E staining |
| Eye ointment | Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd | H44023098 | Material for surgery |
| Fluorescence microscope | Olympus (Japan) | BX51 | Image acquisition |
| GFAP Mouse monoclonal antibody | Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
3670 | Primary antibody for IF staining |
| Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG |
Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
4408 | Second antibody for IF staining |
| Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG |
Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
8889 | Second antibody for IF staining |
| Grip strength meter | Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd. | XR501 | Equipment for behavioral test |
| Hematoxylin staining solution | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. |
G1004 | Dye for H&E staining |
| Iba1 Rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab178846 | Primary antibody for IF staining |
| Isoflurane | Rwd Life Science Co., Ltd. | R510-22-10 | Anesthetized animal |
| Laser doppler blood flow meter | Moor Instruments (UK) | moorVMS | Blood flow monitoring |
| Meloxicam | Boehringer-Ingelheim | J20160020 | Analgesia for animal |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd. | 78001 | Equipment for surgery |
| Microsurgical instruments set | Rwd Life Science Co., Ltd. | SP0009-R | Equipment for surgery |
| Microtome | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Tissue section production |
| Microtome blade | Leica Biosystems (Germany) | 819 | Tissue section production |
| Monopolar electrocoagulation generator | Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd. |
CZ0001 | Equipment for surgery |
| Mupirocin ointment | Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd. |
H10930064 | Anti-infection for animal |
| NeuN Rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) |
24307 | Primary antibody for IF staining |
| Neutral balsam | Absin Bioscience | abs9177 | Seal for H&E staining |
| Paraffin embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | Euthanized animal |
| Phosphate buffered saline | Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd | C0221A | Rinsing for tissue section |
| Shaver | Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd. |
CP-9200 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution | Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd. | P0083 | Antigen retrieval for IF staining |
References
- Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC Focus Seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
- GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2019).
- Joo, H., Wang, G., George, M. G. A literature review of cost-effectiveness of intravenous recombinant tissue plasminogen activator for treating acute ischemic stroke. Stroke Vasc Neurol. 2 (2), 73-83 (2017).
- Jones, A. T., O’Connell, N. K., David, A. S. Epidemiology of functional stroke mimic patients: a systematic review and meta-analysis. Eur J Neurol. 27 (1), 18-26 (2020).
- Tamura, A., et al. Focal cerebral ischaemia in the rat: Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Candelario-Jalil, E., Paul, S. Impact of aging and comorbidities on ischemic stroke outcomes in preclinical animal models: A translational perspective. J Exp Neurol. 335, 113494 (2021).
- Zuo, X., et al. Attenuation of secondary damage and Aβ deposits in the ipsilateral thalamus of dMCAO rats through reduction of cathepsin B by bis(propyl)-cognitin, a multifunctional dimer. Neuropharmacology. 162, 107786 (2020).
- Shabani, Z., Farhoudi, M., Rahbarghazi, R., Karimipour, M., Mehrad, H. Cellular, histological, and behavioral pathological alterations associated with the mouse model of photothrombotic ischemic stroke. J Chem Neuroanat. 130, 102261 (2023).
- Caleo, M. Rehabilitation and plasticity following stroke: Insights from rodent models. Neuroscience. 311, 180-194 (2015).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. J Vis Exp. (89), e51729 (2014).
- Lavayen, B. P., et al. Neuroprotection by the cannabidiol aminoquinone VCE-004.8 in experimental ischemic stroke in mice. Neurochem Int. 165, 105508 (2023).
- Hu, K., et al. Cathepsin B knockout confers significant brain protection in the mouse model of stroke. J Exp Neurol. 368, 114499 (2023).
- Yu, S. P., et al. Optochemogenetic stimulation of transplanted iPS-NPCs enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. J Neurosci. 39 (33), 6571-6594 (2019).
- Lin, Y. H., et al. Opening a new time window for treatment of stroke by targeting HDAC2. J Neurosci. 37 (28), 6712-6728 (2017).
- Shi, X. F., Ai, H., Lu, W., Cai, F. SAT: Free software for the semi-automated analysis of rodent brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining. Front Neurosci. 13, 102 (2019).
- Jensen, E. C., et al. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat Rec. 296 (3), 378-381 (2013).
- Donahue, J., Wintermark, M. Perfusion CT and acute stroke imaging: foundations, applications, and literature review. J Neuroradiol. 42 (1), 21-29 (2015).
- Sun, M., et al. Long-term L-3-n-butylphthalide pretreatment attenuates ischemic brain injury in mice with permanent distal middle cerebral artery occlusion through the Nrf2 pathway. Heliyon. 8 (7), e09909 (2022).
- Balkaya, M. G., Trueman, R. C., Boltze, J., Corbett, D., Jolkkonen, J. Behavioral outcome measures to improve experimental stroke research. Behav Brain Res. 352, 161-171 (2018).
- Hao, T., et al. Inflammatory mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury with treatment of stepharine in rats. Phytomedicine. 79, 153353 (2020).
- Pietrogrande, G., et al. Low oxygen post conditioning prevents thalamic secondary neuronal loss caused by excitotoxicity after cortical stroke. Sci Rep. 9 (1), 4841 (2019).
- Shi, X., et al. Stroke subtype-dependent synapse elimination by reactive gliosis in mice. Nat Commun. 12 (1), 6943 (2021).
- Chen, W. C., et al. Aryl hydrocarbon receptor modulates stroke-induced astrogliosis and neurogenesis in the adult mouse brain. JNeuroinflammation. 16 (1), 187 (2019).
