Визуализация кальция в режиме реального времени инфицированных вирусом монослоев органоидов кишечника человека с использованием генетически кодируемых кальциевых индикаторов

Кальций является широко консервативным вторичным мессенджером, который играет важнейшую роль в регуляции клеточной физиологии¹. Учитывая его сильный заряд, небольшой размер и высокую растворимость в физиологических условиях, кальций является идеальным манипулятором конформации белка. Это делает кальций мощным средством для преобразования электрохимических сигналов в ферментативные, транскрипционные или посттранскрипционные изменения. Строгие градиенты концентрации кальция в эндоплазматическом ретикулуме (ER) и плазматических мембранах создают высокую движущую силу, которая позволяет быстро изменять концентрацию цитозольного кальция. Многочисленные механизмы, включая буферизацию и активный транспорт, жестко поддерживают этот градиент. Несмотря на то, что это необходимо для нормального функционирования клеток, это поддержание энергетически затратно, что делает его особенно восприимчивым в стрессовых состояниях^.

Таким образом, дисрегуляция кальция в цитозоле является почти универсальным сигналом многих видов клеточного стресса. Метаболические нарушения, токсины, болезнетворные микроорганизмы, механические повреждения и генетические нарушения могут нарушить передачу сигналов кальция. Независимо от стимула, на уровне всей клетки устойчивое, неконтролируемое повышение цитозольного кальция может способствовать апоптозу и, в конечном^итоге, некрозу^. Однако изменения уровня кальция в цитозолье с более низкой амплитудой или более высокой частотой имеют различные эффекты². Аналогичным образом, результаты флуктуаций кальция могут различаться в зависимости от пространственного микродомена, в котором^{они происходят}. Таким образом, мониторинг уровня кальция может дать представление о динамических сигнальных процессах, но для этого требуется отбор проб с относительно высоким временным и пространственным разрешением.

Генетически кодируемые индикаторы кальция (GECI) являются мощными инструментами для непрерывного отбора проб в системах живых клеток⁶. Одними из наиболее широко используемых GECI являются кальций-чувствительные флуоресцентные белки на основе GFP, известные как GCaMPs⁷. Канонический GCaMP представляет собой слияние трех различных белковых доменов: циркулярно перестановочного GFP (cpGFP), кальмодулина и M13⁶. Домен кальмодулина претерпевает конформационные изменения при связывании кальция, что позволяет ему взаимодействовать с М13. Взаимодействие кальмодулина и М13 индуцирует конформационное изменение cpGFP, которое увеличивает его флуоресцентное излучение при возбуждении. Таким образом, увеличение концентрации кальция коррелирует с увеличением интенсивности флуоресценции GCaMP. Эти сенсоры могут быть цитозольными или нацеленными на конкретные органеллы⁸.

Как и большинство тканей, кальций регулирует различные функции в эпителии желудочно-кишечного тракта. Кишечный эпителий является неотъемлемой частью всасывания питательных веществ и жидкости, но также должен образовывать плотный барьер и иммунный интерфейс, чтобы избежать инвазии патогенов или токсического раздражения. Кальций-зависимые пути влияют почти на все эти жизненно важные функции ^9,10,11. Тем не менее, передача сигналов кальция в кишечном эпителии остается малоизученным рубежом с многообещающим потенциалом в качестве терапевтической мишени. В то время как мониторинг динамики кальция в кишечном эпителии in vivo по-прежнему представляет собой проблему, кишечные органоиды человека (HIO) предлагают адаптируемую систему ex vivo для экспериментов¹². HIO представляют собой трехмерные (3D) сфероиды, полученные из стволовых клеток кишечника человека и при дифференцировке повторяют большую часть клеточного разнообразия нативного кишечного эпителия¹².

Этот протокол описывает комплексные методы разработки HIO, экспрессирующих GECI, а затем подготовки сконструированных HIO в виде монослоев для визуализации живых клеток кальция. В качестве примера патологической манипуляции, которая нарушает передачу сигналов кальция, предлагается вирусная инфекция, а также аналитический подход к количественной оценке этих изменений.