تصوير الكالسيوم الحي للطبقات العضوية المعوية البشرية المصابة بالفيروس باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا
Summary
يصف هذا البروتوكول نهجا لإجراء تصوير الكالسيوم في العضويات المعوية البشرية المصابة بالفيروس ويقدم نهجا للتحليل.
Abstract
إشارات الكالسيوم هي منظم متكامل لكل الأنسجة تقريبا. داخل ظهارة الأمعاء ، يشارك الكالسيوم في تنظيم النشاط الإفرازي ، وديناميات الأكتين ، والاستجابات الالتهابية ، وتكاثر الخلايا الجذعية ، والعديد من الوظائف الخلوية الأخرى غير المميزة. على هذا النحو ، يمكن أن يوفر رسم خرائط ديناميكيات إشارات الكالسيوم داخل ظهارة الأمعاء نظرة ثاقبة للعمليات الخلوية الاستتبابية ويكشف النقاب عن استجابات فريدة لمختلف المحفزات. الكائنات العضوية المعوية البشرية (HIOs) هي نموذج عالي الإنتاجية مشتق من الإنسان لدراسة ظهارة الأمعاء ، وبالتالي تمثل نظاما مفيدا للتحقيق في ديناميكيات الكالسيوم. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتحويل HIOs بثبات باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) ، وإجراء الفحص المجهري الفلوري الحي ، وتحليل بيانات التصوير لتوصيف إشارات الكالسيوم بشكل هادف. كمثال تمثيلي ، تم تحويل HIOs ثلاثية الأبعاد مع فيروس lentivirus للتعبير بثبات عن GCaMP6s ، وهو GECI خلوي أخضر قائم على البروتين الفلوري. ثم تم تشتيت HIOs المصممة هندسيا في تعليق أحادي الخلية وبذرها كطبقة أحادية. بعد التمايز ، أصيبت أحاديات HIO بفيروس الروتا و / أو عولجت بالأدوية المعروفة بتحفيز استجابة الكالسيوم. سمح مجهر التألق الفائق المزود بغرفة تصوير حية مرطبة يتم التحكم في درجة حرارتها بالتصوير طويل الأمد للطبقات الأحادية المصابة أو المعالجة بالأدوية. بعد التصوير ، تم تحليل الصور المكتسبة باستخدام برنامج التحليل المتاح مجانا ، ImageJ. بشكل عام ، ينشئ هذا العمل خط أنابيب قابل للتكيف لتوصيف الإشارات الخلوية في HIOs.
Introduction
الكالسيوم هو رسول ثان محفوظ على نطاق واسع يلعب دورا مهما في تنظيم علم وظائف الأعضاء الخلوية1. نظرا لشحنته القوية وصغر حجمه وقابليته العالية للذوبان في الظروف الفسيولوجية ، فإن الكالسيوم هو مناور مثالي لتشكل البروتين. هذا يجعل الكالسيوم وسيلة قوية لتحويل الإشارات الكهروكيميائية إلى تعديلات إنزيمية أو نسخية أو ما بعد النسخ. تخلق تدرجات تركيز الكالسيوم الصارمة عبر الشبكة الإندوبلازمية (ER) وأغشية البلازما قوة دافعة عالية تسمح بتغيرات سريعة في تركيز الكالسيوم الخلوي. آليات متعددة ، بما في ذلك كل من التخزين المؤقت والنقل النشط ، تحافظ بإحكام على هذا التدرج. في حين أن هذه الصيانة ضرورية للوظائف الخلوية العادية ، إلا أنها مكلفة للغاية ، مما يجعلها عرضة بشكل خاص في حالات الإجهاد 2.
على هذا النحو ، فإن عدم تنظيم الكالسيوم داخل السيتوسول هو إشارة شبه عالمية لأنواع كثيرة من الإجهاد الخلوي. يمكن أن تؤدي الاضطرابات الأيضية والسموم ومسببات الأمراض والأضرار الميكانيكية والاضطرابات الوراثية إلى تعطيل إشارات الكالسيوم. بغض النظر عن التحفيز ، على مستوى الخلية الكاملة ، يمكن أن تؤدي الارتفاعات المستمرة وغير المنضبطة في الكالسيوم الخلوي إلى تعزيز موت الخلايا المبرمج وفي النهاية نخر 3,4. ومع ذلك ، فإن التغيرات في مستويات الكالسيوم الخلوية ذات السعة المنخفضة أو التردد الأعلى لها تأثيرات متفاوتة2. وبالمثل ، قد تختلف نتائج تقلبات الكالسيوم بناء على المجال الدقيق المكاني الذي تحدث فيه5. وبالتالي ، يمكن أن توفر مراقبة مستويات الكالسيوم نظرة ثاقبة لعمليات الإشارات الديناميكية ، ولكن هذا يتطلب أخذ عينات بدقة زمنية ومكانية عالية نسبيا.
مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) هي أدوات قوية لأخذ العينات المستمرة في أنظمة الخلايا الحية6. بعض GECIs الأكثر استخداما هي بروتينات الفلورسنت المستجيبة للكالسيوم القائمة على GFP والمعروفة باسم GCaMPs7. GCaMP المتعارف عليه هو مزيج من ثلاثة مجالات بروتينية متميزة: GFP متغير دائريا (cpGFP) ، كالمودولين ، و M136. يخضع مجال الكالمودولين لتغيير التشكل عند ربط الكالسيوم ، مما يسمح بتفاعله مع M13. يؤدي تفاعل الكالمودولين-M13 إلى حدوث تغيير توافقي في cpGFP يزيد من انبعاث الفلورسنت عند الإثارة. على هذا النحو ، ترتبط الزيادة في تركيز الكالسيوم بزيادة شدة مضان GCaMP. يمكن أن تكون هذه المستشعرات خلوية أو تستهدف عضيات معينة8.
على غرار معظم الأنسجة ، ينظم الكالسيوم مجموعة متنوعة من الوظائف داخل ظهارة الجهاز الهضمي. تعتبر ظهارة الأمعاء جزءا لا يتجزأ من امتصاص المغذيات والسوائل ولكن يجب أيضا أن تشكل حاجزا ضيقا وواجهة مناعية لتجنب غزو مسببات الأمراض أو الإهانات السامة. تؤثر المسارات المعتمدة على الكالسيوم على جميع هذه الوظائف الحيوية تقريبا9،10،11. ومع ذلك ، لا تزال إشارات الكالسيوم داخل ظهارة الأمعاء حدودا غير مستكشفة مع إمكانات واعدة كهدف علاجي. بينما تستمر مراقبة ديناميكيات الكالسيوم داخل ظهارة الأمعاء في الجسم الحي في تقديم تحديات ، تقدم الكائنات العضوية المعوية البشرية (HIOs) نظاما قابلا للتكيف خارج الجسم الحي للتجريب12. HIOs هي كرويات ثلاثية الأبعاد (3D) مشتقة من الخلايا الجذعية المعوية البشرية ، وعند التمايز ، تلخص الكثير من التنوع الخلوي لظهارة الأمعاء الأصلية12.
يصف هذا البروتوكول طرقا شاملة لهندسة HIOs التي تعبر عن GECIs ثم إعداد HIOs المهندسة كطبقة أحادية لتصوير الكالسيوم بالخلايا الحية. يقدم العدوى الفيروسية كمثال على التلاعب المرضي الذي يعطل إشارات الكالسيوم ويوفر نهجا تحليليا لتحديد هذه التغييرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن تكون التغيرات في مستويات Ca2+ الخلوية سببا ونتيجة للأمراض داخل الظهارة10،16،17. يمكن أن تؤدي الزيادات في الكالسيوم الخلوي إلى زيادة الإفراز مباشرة عن طريق تنشيط قناة الكلوريد المعتمدة على الكالسيوم TMEM16A18,19<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح R01DK115507 و R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) من المعاهد الوطنية للصحة (NIH). تم تقديم دعم المتدربين من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة F30DK131828 (PI: J.T. Gebert) و F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) و F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). نود أن نشكر مركز تكساس الطبي لأمراض الجهاز الهضمي Enteroid Core لتوفير وسائط الصيانة العضوية.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
- Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
- Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
- Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
- Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
- Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
- Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
- Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
- Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
- Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
- Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
- Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
- Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
- Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
- Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
- Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
- Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
- Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
- Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
- Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
- Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
- Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
- Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
- Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
- Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
