Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente
Summary
Este protocolo descreve uma abordagem para a realização de imagens de cálcio em organoides intestinais humanos infectados por vírus e oferece uma abordagem para análise.
Abstract
A sinalização de cálcio é um regulador integral de quase todos os tecidos. Dentro do epitélio intestinal, o cálcio está envolvido na regulação da atividade secretora, dinâmica da actina, respostas inflamatórias, proliferação de células-tronco e muitas outras funções celulares não caracterizadas. Como tal, o mapeamento da dinâmica de sinalização do cálcio dentro do epitélio intestinal pode fornecer informações sobre os processos celulares homeostáticos e revelar respostas únicas a vários estímulos. Os organoides intestinais humanos (HIOs) são um modelo de alto rendimento, derivado do ser humano, para estudar o epitélio intestinal e, portanto, representam um sistema útil para investigar a dinâmica do cálcio. Este artigo descreve um protocolo para transduzir HIOs de forma estável com indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs), realizar microscopia de fluorescência ao vivo e analisar dados de imagem para caracterizar significativamente os sinais de cálcio. Como um exemplo representativo, HIOs 3-dimensionais foram transduzidos com lentivírus para expressar de forma estável GCaMP6s, um GECI citosólico baseado em proteína fluorescente verde. Os HIOs projetados foram então dispersos em uma suspensão de célula única e semeados como monocamadas. Após a diferenciação, as monocamadas de HIO foram infectadas com rotavírus e/ou tratadas com drogas conhecidas por estimular uma resposta de cálcio. Um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmara de imagem viva umidificada e com temperatura controlada permitiu a obtenção de imagens de longo prazo de monocamadas infectadas ou tratadas com drogas. Após a aquisição de imagem, as imagens adquiridas foram analisadas usando o software de análise disponível gratuitamente, ImageJ. De modo geral, este trabalho estabelece um pipeline adaptável para caracterizar a sinalização celular em HIOs.
Introduction
O cálcio é um segundo mensageiro amplamente conservado que desempenha um papel crítico na regulação da fisiologia celular1. Dada a sua forte carga, tamanho pequeno e alta solubilidade em condições fisiológicas, o cálcio é um manipulador ideal da conformação proteica. Isso torna o cálcio um meio poderoso para transduzir sinais eletroquímicos em alterações enzimáticas, transcricionais ou pós-transcricionais. Os rígidos gradientes de concentração de cálcio através do retículo endoplasmático (RE) e membranas plasmáticas criam uma alta força motriz que permite mudanças rápidas na concentração citosólica de cálcio. Vários mecanismos, incluindo buffering e transporte ativo, mantêm firmemente esse gradiente. Embora necessária para as funções celulares normais, essa manutenção é energeticamente cara, tornando-a particularmente suscetível em estados de estresse 2.
Como tal, a desregulação do cálcio dentro do citosol é um sinal quase universal de muitos tipos de estresse celular. Distúrbios metabólicos, toxinas, patógenos, danos mecânicos e perturbações genéticas podem interromper a sinalização do cálcio. Independentemente do estímulo, em nível de células inteiras, elevações sustentadas e descontroladas do cálcio citosólico podem promover apoptose e, eventualmente, necrose 3,4. Alterações nos níveis citosólicos de cálcio de menor amplitude ou maior frequência, entretanto, têm efeitos variáveis2. Da mesma forma, os resultados das flutuações do cálcio podem diferir com base no microdomínio espacial em que ocorrem5. O monitoramento dos níveis de cálcio pode, portanto, oferecer informações sobre processos dinâmicos de sinalização, mas isso requer amostragem com resolução temporal e espacial relativamente alta.
Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs) são ferramentas poderosas para amostragem contínua em sistemas de células vivas6. Algumas das GECIs mais utilizadas são as proteínas fluorescentes responsivas ao cálcio baseadas em GFP, conhecidas como GCaMPs7. A GCaMP canônica é uma fusão de três domínios proteicos distintos: uma GFP circularmente permutada (cpGFP), calmodulina e M136. O domínio da calmodulina sofre uma mudança de conformação ao se ligar ao cálcio, permitindo sua interação com M13. A interação calmodulina-M13 induz uma mudança conformacional na cpGFP que aumenta sua emissão fluorescente após excitação. Como tal, um aumento na concentração de cálcio correlaciona-se com um aumento na intensidade de fluorescência do GCaMP. Esses sensores podem ser citosólicos ou direcionados para organelasespecíficas8.
Semelhante à maioria dos tecidos, o cálcio regula uma variedade de funções dentro do epitélio gastrointestinal. O epitélio intestinal é essencial para a absorção de nutrientes e fluidos, mas também deve formar uma barreira apertada e interface imunológica para evitar a invasão de patógenos ou insultos tóxicos. As vias dependentes de cálcio influenciam quase todas essas funções vitais 9,10,11. No entanto, a sinalização do cálcio dentro do epitélio intestinal permanece uma fronteira pouco explorada com potencial promissor como alvo terapêutico. Enquanto o monitoramento da dinâmica do cálcio no epitélio intestinal in vivo continua a apresentar desafios, os organoides intestinais humanos (HIOs) oferecem um sistema ex vivo adaptável para experimentação12. As HIOs são esferoides tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco intestinais humanas e, ao serem diferenciadas, recapitulam grande parte da diversidade celular do epitélio intestinal nativo12.
Este protocolo descreve métodos abrangentes para projetar HIOs que expressam GECIs e, em seguida, preparar HIOs projetados como monocamadas para imagens de cálcio de células vivas. Ele oferece a infecção viral como um exemplo de manipulação patológica que interrompe a sinalização de cálcio e fornece uma abordagem analítica para quantificar essas alterações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alterações nos níveis citosólicos de Ca2+ podem ser causa e efeito de patologias do epitélio 10,16,17. O aumento do cálcio citosólico pode direcionar diretamente a secreção via ativação do canal de cloreto cálcio-dependente TMEM16A18,19. A ativação do TMEM16A em resposta ao Ca2+ permite o efluxo apical de cloreto, estabelecendo um grad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios R01DK115507 e R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) do National Institutes of Health (NIH). O apoio aos estagiários foi fornecido pelos F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) e F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Gostaríamos de agradecer ao Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core por fornecer o meio de manutenção de organoides.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
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