遺伝子コードされたカルシウムインジケーターを用いたウイルス感染ヒト腸オルガノイド単分子膜のライブカルシウムイメージング

カルシウムは広く保存されているセカンドメッセンジャーであり、細胞生理機能の調節に重要な役割を果たしています¹。カルシウムは、その強い電荷、小型、および生理学的条件での高い溶解性を考えると、タンパク質のコンフォメーションの理想的なマニピュレーターです。これにより、カルシウムは電気化学的シグナルを酵素的、転写的、または転写後の変化に変換する強力な手段になります。小胞体(ER)と原形質膜を横切る厳密なカルシウム濃度勾配は、細胞質カルシウム濃度の急速な変化を可能にする高い駆動力を生み出します。バッファリングとアクティブトランスポートの両方を含む複数のメカニズムが、この勾配を厳密に維持します。正常な細胞機能には必要であるが、この維持はエネルギー的に高価であり ^{、ストレス状態}において特に影響を受けやすい2。

このように、細胞質内のカルシウムの調節不全は、多くの種類の細胞ストレスのほぼ普遍的なシグナルです。代謝障害、毒素、病原体、機械的損傷、遺伝的摂動はすべて、カルシウムシグナル伝達を混乱させる可能性があります。刺激に関係なく、細胞レベルでは、細胞質カルシウムの持続的で制御不能な上昇は、アポトーシスを促進し、最終的には壊死を促進する可能性があります^3,4。しかし、低振幅または高頻度の細胞質カルシウムレベルの変化は、^{さまざまな影響を及ぼします}2。同様に、カルシウム変動の結果は、^{変動が発生する空間}的ミクロドメインによって異なる可能性があります5。したがって、カルシウムレベルをモニタリングすることで、動的シグナル伝達プロセスに関する洞察を得ることができますが、そのためには比較的高い時間分解能と空間分解能でのサンプリングが必要です。

遺伝子コードされたカルシウム指標(GECI)は、生細胞システムでの連続サンプリングのための強力なツールです⁶。最も広く使用されているGECIには、GCaMP^{として知られる}GFPベースのカルシウム応答性蛍光タンパク質があります7。標準的なGCaMPは、環状に順列されたGFP(cpGFP)、カルモジュリン、およびM13⁶の3つの異なるタンパク質ドメインの融合です。カルモジュリンドメインは、カルシウムの結合時にコンフォメーション変化を起こし、M13との相互作用を可能にします。カルモジュリン-M13相互作用は、cpGFPの立体構造変化を誘発し、励起時の蛍光発光を増加させます。そのため、カルシウム濃度の上昇はGCaMP蛍光強度の増加と相関します。これらのセンサーは、細胞質である場合もあれば、特定の細胞小器官を標的とする場合^{もある8。}

ほとんどの組織と同様に、カルシウムは消化管上皮内のさまざまな機能を調節します。腸上皮は栄養素と体液の吸収に不可欠ですが、病原体の侵入や有毒な侮辱を避けるために、タイトなバリアと免疫インターフェースを形成する必要があります。カルシウム依存性経路は、これらの生命機能のほぼすべてに影響を与えます^9,10,11。しかし、腸上皮内のカルシウムシグナル伝達は未開拓のフロンティアであり、治療標的として有望な可能性を秘めています。in vivoでの腸上皮内のカルシウム動態のモニタリングは引き続き課題となっていますが、ヒト腸オルガノイド(HIO)は実験に適応可能なex vivoシステムを提供します¹²。HIOは、ヒト腸管幹細胞に由来する3次元(3D)スフェロイドであり、分化すると、天然の腸上皮の細胞多様性の多くを再現する¹²。

このプロトコールでは、GECIを発現するHIOを設計し、生細胞カルシウムイメージング用の単層として設計されたHIOを調製するための包括的な方法について説明します。カルシウムシグナル伝達を破壊する病理学的操作の例としてウイルス感染を提供し、これらの変化を定量化するための分析的アプローチを提供します。