Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Kalzium ist ein weit verbreiteter sekundärer Botenstoff, der eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Zellphysiologie spielt¹. Aufgrund seiner starken Ladung, seiner geringen Größe und seiner hohen Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen ist Kalzium ein idealer Manipulator der Proteinkonformation. Dies macht Kalzium zu einem leistungsstarken Mittel, um elektrochemische Signale in enzymatische, transkriptionelle oder posttranskriptionelle Veränderungen umzuwandeln. Die strengen Kalziumkonzentrationsgradienten über das endoplasmatische Retikulum (ER) und die Plasmamembranen erzeugen eine hohe Antriebskraft, die schnelle Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration ermöglicht. Mehrere Mechanismen, darunter sowohl die Pufferung als auch der aktive Transport, halten diesen Gradienten aufrecht. Diese Aufrechterhaltung ist zwar für normale Zellfunktionen notwendig, aber energetisch teuer, was sie besonders anfällig für Stresszustände macht ².

Daher ist eine Dysregulation von Kalzium im Zytosol ein nahezu universelles Signal für viele Arten von zellulärem Stress. Stoffwechselstörungen, Toxine, Krankheitserreger, mechanische Schäden und genetische Störungen können die Kalziumsignalisierung stören. Unabhängig vom Stimulus kann ein anhaltender, unkontrollierter Anstieg des zytosolischen Kalziums auf Ganzzellebene die Apoptose und schließlich die Nekrose fördern ^3,4. Veränderungen des zytosolischen Kalziumspiegels mit geringerer Amplitude oder höherer Frequenz haben jedoch unterschiedliche Auswirkungen². Ebenso können die Ergebnisse von Kalziumschwankungen je nach räumlicher Mikrodomäne, in der sie auftreten, unterschiedlich sein⁵. Die Überwachung des Kalziumspiegels kann daher Aufschluss über dynamische Signalprozesse geben, erfordert jedoch eine Probenahme mit relativ hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) sind leistungsfähige Werkzeuge für die kontinuierliche Probenahme in lebenden Zellsystemen⁶. Einige der am weitesten verbreiteten GECIs sind GFP-basierte, auf Kalzium reagierende fluoreszierende Proteine, die als GCaMPs^{bekannt sind 7}. Die kanonische GCaMP ist eine Fusion von drei verschiedenen Proteindomänen: einem zirkulär permutierten GFP (cpGFP), Calmodulin und M13⁶. Die Calmodulindomäne erfährt bei der Bindung von Kalzium eine Konformationsänderung, die ihre Interaktion mit M13 ermöglicht. Die Calmodulin-M13-Wechselwirkung induziert eine Konformationsänderung des cpGFP, die seine Fluoreszenzemission bei Anregung erhöht. Daher korreliert ein Anstieg der Kalziumkonzentration mit einem Anstieg der GCaMP-Fluoreszenzintensität. Diese Sensoren können zytosolisch oder auf bestimmte Organellen gerichtet sein⁸.

Ähnlich wie die meisten Gewebe reguliert Kalzium eine Vielzahl von Funktionen innerhalb des Magen-Darm-Epithels. Das Darmepithel ist ein wesentlicher Bestandteil der Nährstoff- und Flüssigkeitsaufnahme, muss aber auch eine dichte Barriere und Immunschnittstelle bilden, um das Eindringen von Krankheitserregern oder toxische Beleidigungen zu vermeiden. Kalziumabhängige Signalwege beeinflussen fast alle diese lebenswichtigen Funktionen ^9,10,11. Die Kalziumsignalisierung im Darmepithel ist jedoch nach wie vor ein wenig erforschtes Gebiet mit vielversprechendem Potenzial als therapeutisches Ziel. Während die Überwachung der Kalziumdynamik im Darmepithel in vivo weiterhin eine Herausforderung darstellt, bieten humane Darmorganoide (HIOs) ein anpassungsfähiges ex vivo System für Experimente¹². HIOs sind 3-dimensionale (3D) Sphäroide, die aus menschlichen Darmstammzellen gewonnen werden und bei Differenzierung einen Großteil der zellulären Vielfalt des nativen Darmepithels rekapitulieren¹².

Dieses Protokoll beschreibt umfassende Methoden zur Entwicklung von HIOs, die GECIs exprimieren, und zur Herstellung von künstlich hergestellten HIOs als Monolayer für die Kalziumbildgebung lebender Zellen. Es bietet eine Virusinfektion als Beispiel für eine pathologische Manipulation, die die Kalziumsignalisierung stört, und bietet einen analytischen Ansatz zur Quantifizierung dieser Veränderungen.