Levende calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïde monolagen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren
Summary
Dit protocol beschrijft een aanpak voor het uitvoeren van calciumbeeldvorming in met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïden en biedt een benadering voor analyse.
Abstract
Calciumsignalering is een integrale regulator van bijna elk weefsel. Binnen het darmepitheel is calcium betrokken bij de regulatie van secretoire activiteit, actinedynamiek, ontstekingsreacties, stamcelproliferatie en vele andere niet-gekarakteriseerde cellulaire functies. Als zodanig kan het in kaart brengen van de dynamiek van calciumsignalering in het darmepitheel inzicht geven in homeostatische cellulaire processen en unieke reacties op verschillende stimuli onthullen. Menselijke darmorganoïden (HIO’s) zijn een high-throughput, van mensen afgeleid model om het darmepitheel te bestuderen en vertegenwoordigen dus een nuttig systeem om de calciumdynamiek te onderzoeken. Dit artikel beschrijft een protocol om HIO’s stabiel te transduceren met genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI’s), live fluorescentiemicroscopie uit te voeren en beeldvormingsgegevens te analyseren om calciumsignalen zinvol te karakteriseren. Als representatief voorbeeld werden 3-dimensionale HIO’s getransduceerd met lentivirus om GCaMP6’s stabiel tot expressie te brengen, een op groen fluorescerend eiwit gebaseerde cytosolische GECI. De gemanipuleerde HIO’s werden vervolgens gedispergeerd in een eencellige suspensie en gezaaid als monolagen. Na differentiatie werden de HIO-monolagen geïnfecteerd met rotavirus en/of behandeld met geneesmiddelen waarvan bekend is dat ze een calciumrespons stimuleren. Een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een temperatuurgecontroleerde, bevochtigde live-beeldvormingskamer maakte het mogelijk om op lange termijn beeldvorming te maken van geïnfecteerde of met medicijnen behandelde monolagen. Na beeldvorming werden de verkregen beelden geanalyseerd met behulp van de vrij verkrijgbare analysesoftware ImageJ. Over het algemeen brengt dit werk een aanpasbare pijplijn tot stand voor het karakteriseren van cellulaire signalering in HIO’s.
Introduction
Calcium is een wijdverbreide tweede boodschapper die een cruciale rol speelt bij het reguleren van de cellulairefysiologie. Gezien zijn sterke lading, kleine formaat en hoge oplosbaarheid in fysiologische omstandigheden, is calcium een ideale manipulator van eiwitconformatie. Dit maakt calcium een krachtig middel om elektrochemische signalen om te zetten in enzymatische, transcriptionele of post-transcriptionele veranderingen. De strikte calciumconcentratiegradiënten over het endoplasmatisch reticulum (ER) en plasmamembranen creëren een hoge drijvende kracht die snelle veranderingen in de cytosolische calciumconcentratie mogelijk maakt. Meerdere mechanismen, waaronder zowel buffering als actief transport, houden deze gradiënt strak in stand. Hoewel dit onderhoud noodzakelijk is voor normale cellulaire functies, is het energetisch duur, waardoor het bijzonder vatbaar is in stresstoestanden.
Als zodanig is ontregeling van calcium in het cytosol een bijna universeel signaal van vele soorten cellulaire stress. Metabole stoornissen, toxines, ziekteverwekkers, mechanische schade en genetische verstoringen kunnen allemaal de calciumsignalering verstoren. Ongeacht de stimulus kan op het niveau van de hele cel aanhoudende, ongecontroleerde stijgingen van cytosolisch calcium apoptose en uiteindelijk necrose bevorderen 3,4. Veranderingen in cytosolische calciumspiegels met een lagere amplitude of een hogere frequentie hebben echter wisselendeeffecten2. Evenzo kunnen de uitkomsten van calciumfluctuaties verschillen op basis van het ruimtelijke microdomein waarin ze voorkomen5. Het monitoren van calciumspiegels kan dus inzicht bieden in dynamische signaleringsprocessen, maar dit vereist bemonstering met een relatief hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI’s) zijn krachtige instrumenten voor continue bemonstering in levende celsystemen6. Enkele van de meest gebruikte GECI’s zijn op GFP gebaseerde calciumresponsieve fluorescerende eiwitten die bekend staan als GCaMPs7. De canonieke GCaMP is een fusie van drie verschillende eiwitdomeinen: een circulair gepermuteerd GFP (cpGFP), calmoduline en M136. Het calmodulinedomein ondergaat een conformatieverandering bij het binden van calcium, waardoor de interactie met M13 mogelijk wordt. De interactie tussen calmoduline en M13 induceert een conformatieverandering in de cpGFP die de fluorescerende emissie bij excitatie verhoogt. Als zodanig correleert een toename van de calciumconcentratie met een toename van de GCaMP-fluorescentie-intensiteit. Deze sensoren kunnen cytosolisch zijn of gericht op specifieke organellen8.
Net als de meeste weefsels reguleert calcium een verscheidenheid aan functies in het gastro-intestinale epitheel. Het darmepitheel is een integraal onderdeel van de opname van voedingsstoffen en vocht, maar moet ook een strakke barrière en immuuninterface vormen om invasie van ziekteverwekkers of toxische beledigingen te voorkomen. Calciumafhankelijke routes beïnvloeden bijna al deze vitale functies 9,10,11. Calciumsignalering in het darmepitheel blijft echter een onderbelichte grens met veelbelovend potentieel als therapeutisch doelwit. Hoewel het monitoren van de calciumdynamiek in het darmepitheel in vivo uitdagingen blijft opleveren, bieden menselijke darmorganoïden (HIO’s) een aanpasbaar ex vivo-systeem voor experimenten12. HIO’s zijn 3-dimensionale (3D) sferoïden afgeleid van menselijke darmstamcellen en recapituleren bij differentiatie een groot deel van de cellulaire diversiteit van het oorspronkelijke darmepitheel12.
Dit protocol beschrijft uitgebreide methoden om HIO’s te ontwikkelen die GECI’s tot expressie brengen en vervolgens gemanipuleerde HIO’s voor te bereiden als monolagen voor calciumbeeldvorming in levende cellen. Het biedt virale infectie als voorbeeld van een pathologische manipulatie die de calciumsignalering verstoort en biedt een analytische benadering om deze veranderingen te kwantificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veranderingen in cytosolischeCa 2+-spiegels kunnen zowel een oorzaak als een gevolg zijn van pathologieën in het epitheel 10,16,17. Verhogingen van cytosolisch calcium kunnen de secretie rechtstreeks stimuleren via activering van het calciumafhankelijke chloridekanaal TMEM16A18,19. Activering van TMEM16A als reactie op Ca2+ zorgt voor de apicale ui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies R01DK115507 en R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) van de National Institutes of Health (NIH). Ondersteuning voor stagiairs werd geboden door NIH-beurzen F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F.J. Scribano) en F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). We willen het Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core bedanken voor het leveren van de organoïde onderhoudsmedia.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
- Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
- Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
- Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
- Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
- Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
- Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
- Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
- Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
- Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
- Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
- Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
- Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
- Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
- Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
- Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
- Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
- Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
- Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
- Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
- Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
- Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
- Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
- Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
- Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
