Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati
Summary
Questo protocollo descrive un approccio per l’esecuzione dell’imaging del calcio in organoidi intestinali umani infettati da virus e offre un approccio all’analisi.
Abstract
La segnalazione del calcio è un regolatore integrale di quasi tutti i tessuti. All’interno dell’epitelio intestinale, il calcio è coinvolto nella regolazione dell’attività secretoria, nella dinamica dell’actina, nelle risposte infiammatorie, nella proliferazione delle cellule staminali e in molte altre funzioni cellulari non caratterizzate. Pertanto, la mappatura delle dinamiche di segnalazione del calcio all’interno dell’epitelio intestinale può fornire informazioni sui processi cellulari omeostatici e svelare risposte uniche a vari stimoli. Gli organoidi intestinali umani (HIO) sono un modello ad alto rendimento, derivato dall’uomo, per studiare l’epitelio intestinale e rappresentano quindi un sistema utile per studiare la dinamica del calcio. Questo documento descrive un protocollo per trasdurre stabilmente HIO con indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), eseguire microscopia a fluorescenza dal vivo e analizzare i dati di imaging per caratterizzare in modo significativo i segnali di calcio. Come esempio rappresentativo, gli HIO tridimensionali sono stati trasdotti con lentivirus per esprimere stabilmente GCaMP6s, un GECI citosolico basato su proteine fluorescenti verdi. Gli HIO ingegnerizzati sono stati poi dispersi in una sospensione a cellula singola e seminati come monostrati. Dopo la differenziazione, i monostrati HIO sono stati infettati con rotavirus e/o trattati con farmaci noti per stimolare una risposta al calcio. Un microscopio a epifluorescenza dotato di una camera di imaging dal vivo umidificata a temperatura controllata ha consentito l’imaging a lungo termine di monostrati infetti o trattati con farmaci. Dopo l’imaging, le immagini acquisite sono state analizzate utilizzando il software di analisi ImageJ, disponibile gratuitamente. Nel complesso, questo lavoro stabilisce una pipeline adattabile per la caratterizzazione della segnalazione cellulare negli HIO.
Introduction
Il calcio è un secondo messaggero ampiamente conservato che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione della fisiologia cellulare1. Data la sua forte carica, le piccole dimensioni e l’elevata solubilità in condizioni fisiologiche, il calcio è un manipolatore ideale della conformazione proteica. Ciò rende il calcio un potente mezzo per trasdurre i segnali elettrochimici in alterazioni enzimatiche, trascrizionali o post-trascrizionali. I rigidi gradienti di concentrazione di calcio attraverso il reticolo endoplasmatico (ER) e le membrane plasmatiche creano un’elevata forza motrice che consente rapidi cambiamenti nella concentrazione citosolica di calcio. Diversi meccanismi, tra cui sia il buffering che il trasporto attivo, mantengono strettamente questo gradiente. Sebbene sia necessaria per le normali funzioni cellulari, questa manutenzione è energeticamente costosa, il che la rende particolarmente suscettibile negli stati di stress 2.
In quanto tale, la disregolazione del calcio all’interno del citosol è un segnale quasi universale di molti tipi di stress cellulare. Disturbi metabolici, tossine, agenti patogeni, danni meccanici e perturbazioni genetiche possono interrompere la segnalazione del calcio. Indipendentemente dallo stimolo, a livello di cellula intera, aumenti sostenuti e incontrollati del calcio citosolico possono promuovere l’apoptosi e infine la necrosi 3,4. Alterazioni dei livelli citosolici di calcio di minore ampiezza o di maggiore frequenza, tuttavia, hanno effetti variabili2. Allo stesso modo, gli esiti delle fluttuazioni del calcio possono differire in base al microdominio spaziale in cui si verificano5. Il monitoraggio dei livelli di calcio può quindi offrire informazioni sui processi di segnalazione dinamica, ma ciò richiede un campionamento con una risoluzione temporale e spaziale relativamente elevata.
Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) sono potenti strumenti per il campionamento continuo in sistemi di cellule vive6. Alcune delle GECI più utilizzate sono proteine fluorescenti reattive al calcio a base di GFP note come GCaMPs7. Il GCaMP canonico è una fusione di tre domini proteici distinti: una GFP permutata circolarmente (cpGFP), calmodulina e M136. Il dominio calmodulina subisce un cambiamento di conformazione al momento del legame con il calcio, permettendone l’interazione con M13. L’interazione calmodulina-M13 induce un cambiamento conformazionale nella cpGFP che aumenta la sua emissione fluorescente durante l’eccitazione. Pertanto, un aumento della concentrazione di calcio è correlato a un aumento dell’intensità della fluorescenza GCaMP. Questi sensori possono essere citosolici o mirati a specifici organelli8.
Simile alla maggior parte dei tessuti, il calcio regola una varietà di funzioni all’interno dell’epitelio gastrointestinale. L’epitelio intestinale è fondamentale per l’assorbimento dei nutrienti e dei liquidi, ma deve anche formare una barriera stretta e un’interfaccia immunitaria per evitare l’invasione di agenti patogeni o insulti tossici. Le vie calcio-dipendenti influenzano quasi tutte queste funzioni vitali 9,10,11. Tuttavia, la segnalazione del calcio all’interno dell’epitelio intestinale rimane una frontiera poco esplorata con un potenziale promettente come bersaglio terapeutico. Mentre il monitoraggio della dinamica del calcio all’interno dell’epitelio intestinale in vivo continua a presentare sfide, gli organoidi intestinali umani (HIO) offrono un sistema ex vivo adattabile per la sperimentazione12. Gli HIO sono sferoidi tridimensionali (3D) derivati da cellule staminali intestinali umane e, una volta differenziati, ricapitolano gran parte della diversità cellulare dell’epitelio intestinale nativo12.
Questo protocollo descrive metodi completi per ingegnerizzare HIO che esprimono GECI e quindi preparare HIO ingegnerizzati come monostrati per l’imaging del calcio su cellule vive. Offre l’infezione virale come esempio di manipolazione patologica che interrompe la segnalazione del calcio e fornisce un approccio analitico per quantificare questi cambiamenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le alterazioni dei livelli citosolici di Ca2+ possono essere sia causa che effetto di patologie all’interno dell’epitelio 10,16,17. L’aumento del calcio citosolico può guidare direttamente la secrezione attraverso l’attivazione del canale del cloro calcio-dipendente TMEM16A18,19. L’attivazione di TMEM16A in risposta a Ca2+ consente l’efflusso apica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni R01DK115507 e R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) del National Institutes of Health (NIH). Il supporto ai tirocinanti è stato fornito da NIH grants F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) e F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Vorremmo ringraziare il Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core per aver fornito i terreni di mantenimento dell’organoide.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
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