Imagerie calcique en direct de monocouches organoïdes intestinaux humains infectés par un virus à l’aide d’indicateurs de calcium codés génétiquement
Summary
Ce protocole décrit une approche pour effectuer l’imagerie calcique dans les organoïdes intestinaux humains infectés par le virus et propose une approche d’analyse.
Abstract
La signalisation calcique est un régulateur intégral de presque tous les tissus. Dans l’épithélium intestinal, le calcium est impliqué dans la régulation de l’activité sécrétoire, de la dynamique de l’actine, des réponses inflammatoires, de la prolifération des cellules souches et de nombreuses autres fonctions cellulaires non caractérisées. En tant que tel, la cartographie de la dynamique de signalisation du calcium dans l’épithélium intestinal peut fournir un aperçu des processus cellulaires homéostatiques et dévoiler des réponses uniques à divers stimuli. Les organoïdes intestinaux humains (HIO) sont un modèle à haut débit, dérivé de l’homme, pour étudier l’épithélium intestinal et représentent donc un système utile pour étudier la dynamique du calcium. Cet article décrit un protocole permettant de transduire de manière stable les HIO avec des indicateurs calciques génétiquement codés (GECI), d’effectuer une microscopie à fluorescence en direct et d’analyser les données d’imagerie pour caractériser de manière significative les signaux calciques. À titre d’exemple représentatif, des HIO tridimensionnels ont été transduits avec des lentivirus pour exprimer de manière stable GCaMP6s, un GECI cytosolique à base de protéines fluorescentes vertes. Les HIO modifiés ont ensuite été dispersés dans une suspension unicellulaire et ensemencés sous forme de monocouches. Après la différenciation, les monocouches de HIO ont été infectées par le rotavirus et/ou traitées avec des médicaments connus pour stimuler une réponse calcique. Un microscope à épifluorescence équipé d’une chambre d’imagerie en direct humidifiée et à température contrôlée a permis d’imager à long terme des monocouches infectées ou traitées par des médicaments. Après l’imagerie, les images acquises ont été analysées à l’aide du logiciel d’analyse gratuit ImageJ. Dans l’ensemble, ces travaux établissent un pipeline adaptable pour caractériser la signalisation cellulaire dans les DOI.
Introduction
Le calcium est un deuxième messager largement conservé qui joue un rôle essentiel dans la régulation de la physiologie cellulaire1. Compte tenu de sa forte charge, de sa petite taille et de sa grande solubilité dans des conditions physiologiques, le calcium est un manipulateur idéal de la conformation des protéines. Cela fait du calcium un moyen puissant de transduire les signaux électrochimiques en altérations enzymatiques, transcriptionnelles ou post-transcriptionnelles. Les gradients stricts de concentration de calcium à travers le réticulum endoplasmique (RE) et les membranes plasmiques créent une force motrice élevée qui permet des changements rapides de la concentration de calcium cytosolique. De multiples mécanismes, y compris la mise en mémoire tampon et le transport actif, maintiennent étroitement ce gradient. Bien que nécessaire aux fonctions cellulaires normales, cet entretien est coûteux en énergie, ce qui le rend particulièrement sensible aux états de stress 2.
En tant que tel, la dérégulation du calcium dans le cytosol est un signal quasi universel de nombreux types de stress cellulaire. Les perturbations métaboliques, les toxines, les agents pathogènes, les dommages mécaniques et les perturbations génétiques peuvent tous perturber la signalisation du calcium. Quel que soit le stimulus, au niveau de la cellule entière, des augmentations soutenues et incontrôlées du calcium cytosolique peuvent favoriser l’apoptose et éventuellement la nécrose 3,4. Cependant, les altérations des taux de calcium cytosolique de plus faible amplitude ou de fréquence plus élevée ont des effets variables2. De même, les résultats des fluctuations calciques peuvent différer en fonction du microdomaine spatial dans lequel elles se produisent5. La surveillance des niveaux de calcium peut donc donner un aperçu des processus de signalisation dynamiques, mais cela nécessite un échantillonnage avec une résolution temporelle et spatiale relativement élevée.
Les indicateurs calciques génétiquement codés (GECI) sont des outils puissants pour l’échantillonnage continu dans les systèmes de cellules vivantes6. Certains des GECI les plus largement utilisés sont des protéines fluorescentes sensibles au calcium à base de GFP, connues sous le nom de GCaMPs7. Le GCaMP canonique est une fusion de trois domaines protéiques distincts : une GFP permutée circulairement (cpGFP), la calmoduline et M136. Le domaine de la calmoduline subit un changement de conformation lors de la liaison du calcium, ce qui permet son interaction avec M13. L’interaction calmoduline-M13 induit un changement conformationnel de la cpGFP qui augmente son émission fluorescente lors de l’excitation. En tant que tel, une augmentation de la concentration de calcium est corrélée à une augmentation de l’intensité de fluorescence GCaMP. Ces capteurs peuvent être cytosoliques ou ciblés sur des organites spécifiques8.
Comme la plupart des tissus, le calcium régule diverses fonctions au sein de l’épithélium gastro-intestinal. L’épithélium intestinal fait partie intégrante de l’absorption des nutriments et des liquides, mais doit également former une barrière étanche et une interface immunitaire pour éviter l’invasion d’agents pathogènes ou les agressions toxiques. Les voies dépendantes du calcium influencent presque toutes ces fonctions vitales 9,10,11. Cependant, la signalisation calcique dans l’épithélium intestinal reste une frontière sous-explorée avec un potentiel prometteur en tant que cible thérapeutique. Alors que la surveillance de la dynamique du calcium dans l’épithélium intestinal in vivo continue de présenter des défis, les organoïdes intestinaux humains (DOI) offrent un système ex vivo adaptable pour l’expérimentation12. Les HIO sont des sphéroïdes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules souches intestinales humaines et, lors de la différenciation, récapitulent une grande partie de la diversité cellulaire de l’épithélium intestinal natif12.
Ce protocole décrit des méthodes complètes pour concevoir des OIS qui expriment des GECI, puis préparer des OIS modifiés sous forme de monocouches pour l’imagerie du calcium sur cellules vivantes. Il propose l’infection virale comme exemple d’une manipulation pathologique qui perturbe la signalisation calcique et fournit une approche analytique pour quantifier ces changements.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les altérations des taux cytosoliques de Ca2+ peuvent être à la fois une cause et un effet de pathologies au sein de l’épithélium 10,16,17. L’augmentation du calcium cytosolique peut entraîner directement la sécrétion via l’activation du canal chlorure dépendant du calcium TMEM16A18,19. L’activation de TMEM16A en réponse au Ca2+ pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par des subventions R01DK115507 et R01AI158683 (PI : J. M. Hyser) des National Institutes of Health (NIH). Le soutien aux stagiaires a été fourni par des subventions des NIH F30DK131828 (PI : J.T. Gebert), F31DK132942 (PI : F. J. Scribano) et F32DK130288 (PI : K.A. Engevik). Nous tenons à remercier le Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core pour avoir fourni le milieu d’entretien des organoïdes.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
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