Применение монослойного графена в решетках криоэлектронной микроскопии для определения структуры с высоким разрешением
Summary
Применение опорных слоев к сеткам криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) может увеличить плотность частиц, ограничить взаимодействие с границей раздела воздух-вода, уменьшить движение, индуцированное лучом, и улучшить распределение ориентаций частиц. В данной работе описан надежный протокол покрытия криоЭМ-решеток монослоем графена для улучшения подготовки криообразцов.
Abstract
В криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) очищенные макромолекулы наносятся на сетку, несущую дырявую углеродную фольгу; Затем молекулы промокают, чтобы удалить лишнюю жидкость, и быстро замораживают в слое стекловидного льда толщиной примерно 20-100 нм, взвешенном в отверстиях фольги шириной примерно 1 мкм. Полученный образец получают с помощью криогенной просвечивающей электронной микроскопии, а после обработки изображения с помощью соответствующего программного обеспечения можно определить структуры с близким к атомному разрешению. Несмотря на широкое распространение криоЭМ, подготовка образцов остается серьезным узким местом в рабочих процессах криоЭМ, и пользователи часто сталкиваются с проблемами, связанными с плохим поведением образцов во взвешенном стекловидном льду. В последнее время были разработаны методы модификации криоЭМ-сеток с помощью одного непрерывного слоя графена, который действует как опорная поверхность, часто увеличивающая плотность частиц в изображаемой области и может уменьшить взаимодействие между частицами и границей раздела воздух-вода. Здесь мы приводим подробные протоколы для нанесения графена на криоЭМ-решетки и для быстрой оценки относительной гидрофильности полученных сеток. Кроме того, мы описываем метод на основе ЭМ для подтверждения присутствия графена путем визуализации его характерной дифракционной картины. Наконец, мы демонстрируем полезность этих графеновых носителей, быстро реконструируя карту плотности с разрешением 2,7 Å комплекса Cas9 с использованием чистого образца при относительно низкой концентрации.
Introduction
Криогенная электронная микроскопия одиночных частиц (криоЭМ) превратилась в широко используемый метод визуализации биологических макромолекул1. Благодаря достижениям в области прямого обнаружения электронов 2,3,4, сбора данных5 и алгоритмов обработки изображений 6,7,8,9,10, cryoEM теперь способна создавать 3D-структуры с близким к атомному разрешением быстро растущего числа макромолекул 11. Кроме того, используя одномолекулярную природу подхода, пользователи могут определить несколько структур из одного образца 12,13,14,15, что подчеркивает перспективность использования полученных данных для понимания гетерогенных структурных ансамблей 16,17. Несмотря на этот прогресс, сохраняются узкие места в подготовке сетки для криообразцов.
Для структурной характеристики с помощью криоЭМ биологические образцы должны быть хорошо диспергированы в водном растворе, а затем подвергнуты мгновенной заморозке с помощью процесса, называемого витрификацией18,19. Цель состоит в том, чтобы улавливать частицы в равномерно тонком слое стекловидного льда, взвешенного в равномерно расположенных отверстиях, которые, как правило, вырезаны в слое аморфного углерода. Эта узорчатая аморфная углеродная фольга поддерживается сеткой TEM, несущей сетку из медных или золотых опорных стержней. В стандартных рабочих процессах решетки становятся гидрофильными с помощью плазменной обработки тлеющим разрядом перед нанесением образца. Излишки жидкости промокают фильтровальной бумагой, что позволяет белковому раствору образовывать тонкую жидкую пленку через отверстия, которую можно легко остекловыть во время погружной заморозки. Общие проблемы включают локализацию частиц на границе раздела воздух-вода (AWI) и последующую денатурацию 20,21,22 или принятие предпочтительных ориентаций 23,24,25, прилипание частиц к углеродной фольге вместо того, чтобы мигрировать в отверстия, а также кластеризацию и агрегацию частиц в отверстиях26. Еще одной проблемой является неоднородная толщина льда; Толстый лед может привести к более высокому уровню фонового шума на микрофотографиях из-за повышенного рассеяния электронов, в то время как чрезвычайно тонкий лед может исключать более крупные частицы27.
Для решения этих проблем были использованы различные тонкие опорные пленки для покрытия поверхностей сетки, что позволяет частицам оставаться на этих опорах и, в идеале, избегать взаимодействия с границей раздела воздух-вода. Графеновые опоры показали большие перспективы, отчасти из-за их высокой механической прочности в сочетании с минимальным сечением рассеяния, что снижает фоновый сигнал, добавляемый опорным слоем28. В дополнение к своему минимальному вкладу в фоновый шум, графен также демонстрирует замечательную электро- и теплопроводность29. Было показано, что сетки с покрытием из графена и оксида графена обеспечивают более высокую плотность частиц, более равномерное распределение частиц30 и меньшую локализацию к AWI22. Кроме того, графен обеспечивает опорную поверхность, которая может быть дополнительно модифицирована для: 1) настройки физико-химических свойств поверхности сетки посредством функционализации 31,32,33; или 2) парные связывающие агенты, облегчающие аффинную очистку интересующих белков 34,35,36.
В данной статье мы модифицировали существующую процедуру покрытия криоЭМ-сеток одним однородным слоем графена30. Изменения направлены на минимизацию обработки сетки во всем протоколе с целью повышения производительности и воспроизводимости. Кроме того, мы обсуждаем наш подход к оценке эффективности различных УФ/озоновых обработок для придания решеткам гидрофильности перед погружением. Этот этап подготовки криоЭМ образцов с использованием сеток с графеновым покрытием имеет решающее значение, и мы обнаружили, что наш простой метод количественной оценки относительной гидрофильности полученных сеток является полезным. Используя этот протокол, мы демонстрируем полезность использования сеток с графеновым покрытием для определения структуры путем создания 3D-реконструкции с высоким разрешением каталитически неактивного S. pyogenes Cas9 в комплексе с направляющей РНК и ДНК-мишенью.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подготовка образцов для криоЭМ сопряжена с множеством технических проблем, при этом большинство рабочих процессов требуют от исследователей ручных манипуляций с хрупкими сетками с особой осторожностью, чтобы не повредить их. Кроме того, восприимчивость любого образца к витрификации …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Образцы были подготовлены и визуализированы на CryoEM Facility в MIT.nano на микроскопах, приобретенных благодаря Фонду Арнольда и Мейбл Бекман. Устройства для визуализации контактного угла были напечатаны в MIT Metropolis Maker Space. Мы благодарим лаборатории Nieng Yan и Yimo Han, а также сотрудников MIT.nano за их поддержку на протяжении всего процесса внедрения этого метода. В частности, мы выражаем нашу благодарность докторам Гуаньхуэй Гао и Саре Стерлинг за их содержательные дискуссии и отзывы. Эта работа была поддержана грантами NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 и грантом NSF-CAREER 2046778. Исследования в лаборатории Дэвиса поддерживаются Фондом Альфреда. Слоуна, Фондом Джеймса Х. Ферри, J-Clinic Массачусетского технологического института и семьей Уайтхед.
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
- Dubochet, J. Cryo-EM–the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
