Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución

1. Preparación del grafeno CVD Prepare la solución de grabado de grafeno como se describe a continuación.Disuelva 4,6 g de persulfato de amonio (APS) en 20 ml de agua de grado molecular en un vaso de precipitados de 50 ml para obtener una solución de 1 M y cúbralo con papel de aluminio. Deje que APS se disuelva por completo mientras continúa con el paso 1.2. Prepare una sección de grafeno CVD para el recubrimiento de metacrilato de metilo (MMA). Corta con cuidado una sección cuadrada de grafeno CVD. Transfiera el cuadrado a un cubreobjetos (50 mm x 24 mm) dentro de una placa de Petri limpia y cúbralo durante el transporte a la máquina de recubrimiento giratorio.NOTA: Un cuadrado de 18 mm x 18 mm debe producir 25-36 cuadrículas recubiertas de grafeno. 2. Recubrimiento de grafeno CVD con MMA Ajuste la configuración del recubrimiento giratorio a un centrifugado de alta velocidad de 60 s a 2.500 rpm. Coloque con cuidado el grafeno CVD en el mandril del tamaño adecuado.NOTA: Idealmente, el grafeno CVD se extenderá 1-2 mm sobre el borde del mandril seleccionado para evitar la aspiración de MMA en el sistema de vacío. Presione el botón Take/Absorb para activar la bomba de vacío y fijar el grafeno CVD al mandril. Aplique MMA en el centro del cuadrado de grafeno CVD, cierre la tapa y presione el botón Inicio/Parada inmediatamente. Para un cuadrado de 18 mm x 18 mm de grafeno CVD, 40 μL de MMA son suficientes. Una vez que se haya detenido el centrifugado, desconecte la bomba de vacío y recupere con cuidado el grafeno CVD recubierto de MMA con unas pinzas. Invierta el grafeno CVD de modo que el lado recubierto de MMA quede hacia abajo y vuelva a colocarlo en el cubreobjetos de vidrio. 3. Grabado con plasma de la parte posterior de grafeno Transfiera el grafeno CVD en el cubreobjetos al descargador de incandescencia y descargue la luminiscencia durante 30 s a 25 mA con unas pinzas de punta plana. Regrese el grafeno CVD en el cubreobjetos a la placa de Petri y cúbralo durante el transporte al área de grabado de cobre. El recubrimiento MMA protegerá la capa superior de grafeno del grabado por plasma. 4. Corte de cuadrados de grafeno CVD recubiertos de MMA del tamaño de una cuadrícula Use dos pares de pinzas para sostener el cuadrado de grafeno CVD. Tome nota de la orientación del cuadrado de grafeno CVD, mantenga el lado MMA hacia arriba mientras está sujeto a las pinzas (CRITICAL). Corta el grafeno CVD en cuadrados de aproximadamente 3 mm x 3 mm. Use dos juegos de pinzas de acción inversa para este paso para sujetar el cuadrado de grafeno CVD con el lado derecho hacia arriba y anclarlo en su posición, y también para sostener el borde de un cuadrado de 3 mm x 3 mm después de cortarlo del resto del cuadrado. 5. Disolución de sustrato de cobre de grafeno CVD recubierto de MMA Flote con cuidado cada cuadrado de 3 mm x 3 mm en la solución APS. Haga contacto con la superficie de la solución APS antes de soltar cada cuadrado. Incline el vaso de precipitados de tal manera que cada cuadrado pueda colocarse en la solución en un ángulo poco profundo; Esto asegura que el cuadrado no se hunda. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio e incube durante la noche a 25 °C. 6. Eliminación de películas de MMA/grafeno de APS Utilice un cubreobjetos de vidrio con unas dimensiones de 12 mm x 50 mm y extraiga los cuadrados de MMA/grafeno del APS sumergiendo suavemente el cubreobjetos verticalmente en el APS y luego moviendo el cubreobjetos lateralmente de modo que haga codo con un cuadrado flotante de MMA/grafeno. Retire con cuidado el cubreobjetos y asegúrese de que el cuadrado se adhiera completamente al costado del cubreobjetos al retirarlo. Transfiera los cuadrados de MMA/grafeno a un vaso de precipitados limpio de 50 ml lleno de agua de grado molecular durante 20 minutos. Sumerja suavemente el cubreobjetos con un cuadrado de MMA/grafeno unido al agua verticalmente y asegúrese de que el cubreobjetos se desprenda del cubreobjetos al interactuar con la superficie del agua. Repita para todos los cuadrados de MMA/grafeno. 7. Adherir grafeno a las rejillas Con unas pinzas de acción negativa, sumerja suavemente una rejilla verticalmente en el agua con el lado de carbono frente a un cuadrado flotante de MMA/grafeno. Una vez en contacto con el cuadrado, retire con cuidado la rejilla y asegúrese de que el cuadrado se adhiera completamente al lado de carbono de la rejilla al retirarlo. Minimice el movimiento lateral de la rejilla cuando se sumerja en agua para evitar dañar los cuadrados de la rejilla (CRÍTICO). Coloque las rejillas en un cubreobjetos limpio con MMA/grafeno hacia arriba y séquelas al aire durante 1 a 2 minutos. Transfiera las rejillas recubiertas de grafeno/MMA a una placa calefactora ajustada a 130 °C con unas pinzas de punta plana. Cubra con la parte superior de una placa de Petri de vidrio e incube durante 20 min. Retira del fuego y deja enfriar a temperatura ambiente durante 1 a 2 min.PRECAUCIÓN: Tenga cuidado ya que la parte superior de la placa de Petri estará extremadamente caliente. 8. Disolución de MMA con acetona Transfiera todo el cubreobjetos a una placa de Petri llena de 15 ml de acetona. Incubar durante 30 min. Utilizando una pipeta serológica de vidrio limpio, transfiera la acetona, en la que se incubaron las rejillas, a un contenedor de residuos. Agregue con cuidado 15 ml de acetona fresca a la placa de Petri con una pipeta serológica de vidrio limpio. Incubar durante 30 min. Repita estos pasos de lavado para un total de 3 lavados con acetona. 9. Eliminación de acetona residual con isopropanol Después de 3 lavados con acetona, retire la acetona y reemplácela con 15 ml de isopropanol con una pipeta serológica de vidrio limpio. Incubar durante 20 min. Repita 3 veces para un total de 4 lavados con isopropanol. Retire con cuidado las rejillas del isopropanol y séquelas al aire en un cubreobjetos limpio con unas pinzas.NOTA: El isopropanol residual puede dificultar la liberación de las rejillas de las pinzas. Hacer contacto entre la rejilla y el cubreobjetos limpio antes de soltar la rejilla de las pinzas puede aliviar este problema. Evapore los residuos orgánicos transfiriendo el cubreobjetos con rejillas recubiertas de grafeno a una placa calefactora ajustada a 100 °C durante 10 min. Deje enfriar a temperatura ambiente y guárdelo al vacío hasta su uso. 10. Tratamiento UV/ozono de rejillas recubiertas de grafeno Con unas pinzas de acción inversa, coloque suavemente las rejillas en un área de iluminación limpia de un limpiador UV/ozono con el lado recubierto de grafeno hacia arriba. Deslice el área de iluminación para cerrarla y encienda la máquina. Gire el dial de tiempo al tiempo de tratamiento designado para comenzar el tratamiento UV/ozono de las rejillas.NOTA: La duración del tratamiento es un parámetro ajustable, y el exceso de tratamiento tiene el potencial de dañar la red. Han et al.30 recomiendan 10 min de tratamiento UV/ozono, y también hemos encontrado que un tratamiento de 10 min es suficiente. Consulte el paso 12 para obtener orientación sobre cómo ajustar este tiempo de tratamiento. Proceda directamente a sumergir una muestra de crioEM en las rejillas tratadas siguiendo los pasos de inmersión descritos en Koh et al.37.NOTA: Los hidrocarburos atmosféricos pueden acumularse en la superficie de la rejilla después del tratamiento UV/ozono y aumentar la hidrofobicidad de la superficie del grafeno38,39. Para evitar esto, sumerja inmediatamente las rejillas tratadas con UV/ozono. Puede ser ventajoso tratar las rejillas UV/ozono en lotes, por ejemplo, tratar UV/ozono seis rejillas e inmediatamente sumergir esas seis rejillas, luego tratar UV/ozono un segundo lote de rejillas, seguido de sumergir el segundo lote. 11. Captura de una imagen de difracción Asegúrese de que el microscopio esté bien sintonizado con la iluminación paralela establecida y ajuste el desenfoque final a -0,2 μm. Inserte la pantalla fluorescente y el haz se detendrá por completo. Ingrese al modo de difracción para visualizar claramente los puntos de difracción. Adquiera una imagen con una cámara CCD y evalúela con un software de análisis de imágenes.NOTA: Los puntos de difracción más fácilmente observables e identificables generados por una monocapa de grafeno son 6 puntos correspondientes a una frecuencia espacial de 2,13 Å. Utilice una herramienta de medición para estimar la distancia desde el centro del haz difractado hasta uno de estos puntos de difracción en unidades recíprocas. En particular, 2,13 Å 0,47 Å-1. 12. Evaluación de la hidrofilicidad de la red Prepare la configuración de imágenes. Localice un soporte para teléfono, una superficie de imagen de mesa, un teléfono con cámara, una funda de vidrio y una película de parafina. Las imágenes que se muestran aquí se obtuvieron utilizando un soporte de teléfono y una superficie de imagen de mesa que se imprimieron en 3D utilizando los archivos .stl proporcionados, lo que resultó en mediciones de ángulo de contacto más fácilmente reproducibles y cuantificables (Figura suplementaria 1A). Coloque un cubreobjetos de vidrio sobre la superficie plana, luego corte un cuadrado de 1 cm por 1 cm de película de parafina y colóquelo sobre el cubreobjetos de vidrio. Coloque el teléfono en el soporte del teléfono, orientando el teléfono de modo que la cámara quede en el plano con el cubreobjetos de vidrio. Asegure el teléfono en esta posición con bandas elásticas (Figura complementaria 1B). Tome una foto de muestra para verificar que la cámara esté alineada con la superficie de la imagen. Inmediatamente después del tratamiento UV/ozono de las rejillas recubiertas de grafeno, coloque una sola rejilla en el cuadrado de la película de parafina en el cubreobjetos de vidrio. Asegúrese de que el lado del grafeno esté orientado hacia arriba. Agregue una gota de agua de 2 μL en el centro de la superficie de la rejilla con una pipeta e inmediatamente tome una foto.NOTA: Repita este paso después de: i) los intervalos deseados de tratamiento UV/ozono para determinar una duración suficiente del tratamiento; o ii) intervalos de tiempo deseados después del tratamiento UV/ozono para medir cuánto tiempo después del tratamiento la superficie de la rejilla mantiene su carácter hidrofílico. Calcule los ángulos de contacto a partir de fotos importándolas a ImageJ43 y utilizando el complemento de ángulo de contacto. 13. Análisis de una sola partícula del conjunto de datos complejos dCas9 NOTA: Todo el procesamiento de imágenes descrito en este protocolo se realizó utilizando cryoSPARC versión 4.2.1. Preprocese películas mediante los trabajos Patch Motion Correction y Patch CTF Estimation. Realice la selección de partículas mediante el trabajo Selector de blobs, utilizando una mancha esférica cuyo diámetro oscila entre 115 Å y 135 Å. Extraiga partículas mediante el trabajo Extraer de micrografías, utilizando el coeficiente de correlación normalizado (NCC) y umbrales de potencia, lo que da como resultado aproximadamente 200-300 partículas por micrografía. Tenga en cuenta que los umbrales apropiados y el recuento de partículas resultante pueden variar, y los usuarios deben inspeccionar la calidad de la selección en una variedad de micrografías para identificar las condiciones adecuadas. Realice reconstrucciones iniciales multiclase utilizando el trabajo de reconstrucción Ab-initio, que requiere tres clases. Es probable que dos de las tres clases contengan partículas que no sean Cas9, incluidos los contaminantes de la superficie. Seleccione la clase similar a dCas9 para su posterior procesamiento.NOTA: Se pueden aplicar rondas adicionales de reconstrucción Ab-initio multiclase o refinamiento heterogéneo para refinar aún más la pila de partículas. Realice el refinamiento 3D mediante el trabajo Refinamiento no uniforme seleccionando los parámetros predeterminados. Estime la resolución de la reconstrucción utilizando los trabajos de Validación (FSC) y ThreeDFSC, empleando los mapas y la máscara del refinamiento 3D final.