Application du graphène monocouche aux grilles de cryo-microscopie électronique pour la détermination de la structure à haute résolution
Summary
L’application de couches de support aux grilles de microscopie électronique cryogénique (cryoEM) permet d’augmenter la densité des particules, de limiter les interactions avec l’interface air-eau, de réduire les mouvements induits par les faisceaux et d’améliorer la distribution des orientations des particules. Cet article décrit un protocole robuste pour le revêtement des grilles cryoEM avec une monocouche de graphène afin d’améliorer la préparation des échantillons cryogéniques.
Abstract
En microscopie électronique cryogénique (cryoEM), des macromolécules purifiées sont appliquées sur une grille portant une feuille de carbone trouée ; Les molécules sont ensuite tamponnées pour éliminer l’excès de liquide et rapidement congelées dans une couche de glace vitreuse d’environ 20 à 100 nm d’épaisseur, suspendue à travers des trous de feuille d’environ 1 μm de large. L’échantillon obtenu est imagé à l’aide de la microscopie électronique à transmission cryogénique et, après traitement de l’image à l’aide d’un logiciel approprié, des structures de résolution quasi atomique peuvent être déterminées. Malgré l’adoption généralisée de la cryoEM, la préparation des échantillons reste un goulot d’étranglement important dans les flux de travail cryoEM, les utilisateurs rencontrant souvent des problèmes liés au mauvais comportement des échantillons dans la glace vitrée en suspension. Récemment, des méthodes ont été développées pour modifier les grilles cryoEM avec une seule couche continue de graphène, qui agit comme une surface d’appui qui augmente souvent la densité des particules dans la zone d’imagerie et peut réduire les interactions entre les particules et l’interface air-eau. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour l’application du graphène aux grilles cryoEM et pour évaluer rapidement l’hydrophilie relative des grilles résultantes. De plus, nous décrivons une méthode basée sur EM pour confirmer la présence de graphène en visualisant son diagramme de diffraction caractéristique. Enfin, nous démontrons l’utilité de ces supports de graphène en reconstruisant rapidement une carte de densité d’une résolution de 2,7 Å d’un complexe Cas9 à l’aide d’un échantillon pur à une concentration relativement faible.
Introduction
La microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) est devenue une méthode largement utilisée pour visualiser les macromolécules biologiques1. Alimentée par les progrès de la détection directe d’électrons 2,3,4, de l’acquisition de données5 et des algorithmes de traitement d’images 6,7,8,9,10, la cryoEM est désormais capable de produire des structures 3D à résolution quasi atomique d’un nombre croissant de macromolécules11. De plus, en tirant parti de la nature monomoléculaire de l’approche, les utilisateurs peuvent déterminer plusieurs structures à partir d’un seul échantillon 12,13,14,15, ce qui souligne la promesse d’utiliser les données générées pour comprendre des ensembles structurels hétérogènes16,17. Malgré ces progrès, des goulots d’étranglement persistent dans la préparation des grilles cryo-échantillonnées.
Pour la caractérisation structurale par cryoEM, les échantillons biologiques doivent être bien dispersés dans une solution aqueuse, puis doivent être surgelés par un processus appelé vitrification18,19. L’objectif est de capturer les particules dans une couche uniformément mince de glace vitrifiée en suspension à travers des trous régulièrement espacés qui sont généralement découpés en une couche de carbone amorphe. Cette feuille de carbone amorphe à motifs est soutenue par une grille TEM portant un maillage de barres de support en cuivre ou en or. Dans les flux de travail standard, les grilles sont rendues hydrophiles à l’aide d’un traitement plasma à décharge luminescente avant l’application de l’échantillon. L’excès de liquide est tamponné avec du papier filtre, ce qui permet à la solution protéique de former un mince film liquide à travers les trous qui peut être facilement vitrifié pendant la congélation en plongée. Les défis les plus courants comprennent la localisation des particules à l’interface air-eau (AWI) et la dénaturation subséquente 20,21,22 ou l’adoption d’orientations préférées 23,24,25, l’adhérence des particules à la feuille de carbone plutôt que de migrer dans les trous, et le regroupement et l’agrégation des particules à l’intérieur des trous 26. L’épaisseur non uniforme de la glace est une autre préoccupation ; La glace épaisse peut entraîner des niveaux plus élevés de bruit de fond dans les micrographies en raison de l’augmentation de la diffusion des électrons, tandis que la glace extrêmement mince peut exclure les particules plus grosses27.
Pour relever ces défis, une variété de films de support minces ont été utilisés pour recouvrir les surfaces de la grille, permettant aux particules de reposer sur ces supports et, idéalement, d’éviter les interactions avec l’interface air-eau. Les supports en graphène se sont révélés très prometteurs, en partie en raison de leur résistance mécanique élevée associée à leur section efficace de diffusion minimale, ce qui réduit le signal de fond ajouté par la couche de support28. En plus de sa contribution minimale au bruit de fond, le graphène présente également une conductivité électrique et thermique remarquable29. Il a été démontré que les grilles recouvertes de graphène et d’oxyde de graphène permettent d’obtenir une densité de particules plus élevée, une distribution plus uniforme des particules30 et une localisation réduite dans l’AWI22. De plus, le graphène fournit une surface d’appui qui peut être modifiée pour : 1) ajuster les propriétés physico-chimiques de la surface de la grille par fonctionnalisation 31,32,33 ; ou 2) coupler des agents de liaison qui facilitent la purification par affinité des protéines d’intérêt 34,35,36.
Dans cet article, nous avons modifié une procédure existante pour recouvrir les grilles cryoEM d’une seule couche uniforme de graphène30. Les modifications visent à minimiser la manipulation du réseau tout au long du protocole, dans le but d’augmenter le rendement et la reproductibilité. De plus, nous discutons de notre approche pour évaluer l’efficacité de divers traitements UV/ozone pour rendre les grilles hydrophiles avant la plongée. Cette étape de la préparation d’échantillons cryoEM à l’aide de grilles recouvertes de graphène est essentielle, et nous avons trouvé utile notre méthode simple pour quantifier l’hydrophilie relative des grilles résultantes. À l’aide de ce protocole, nous démontrons l’utilité d’utiliser des grilles recouvertes de graphène pour la détermination de la structure en générant une reconstruction 3D à haute résolution de S. pyogenes Cas9 catalytiquement inactif en complexe avec l’ARN guide et l’ADN cible.
Protocol
Representative Results
Discussion
La préparation d’échantillons cryoEM implique une multitude de défis techniques, la plupart des flux de travail exigeant des chercheurs qu’ils manipulent manuellement des grilles fragiles avec un soin extrême pour éviter de les endommager. De plus, l’aptitude d’un échantillon à la vitrification est imprévisible ; Les particules interagissent souvent avec l’interface air-eau ou avec la feuille de support solide qui recouvre les grilles, ce qui peut conduire les particules à adopter des orientations pré…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Des échantillons ont été préparés et imagés à l’installation CryoEM du MIT.nano sur des microscopes acquis grâce à la Fondation Arnold et Mabel Beckman. Des appareils d’imagerie d’angle de contact ont été imprimés au MIT Metropolis Maker Space. Nous remercions les laboratoires de Nieng Yan et Yimo Han, ainsi que le personnel de MIT.nano pour leur soutien tout au long de l’adoption de cette méthode. Nous remercions tout particulièrement les Drs Guanhui Gao et Sarah Sterling pour leurs discussions et leurs commentaires perspicaces. Ce travail a été soutenu par les subventions R01-GM144542, 5T32-GM007287 des NIH et les subventions NSF-CAREER 2046778. La recherche dans le laboratoire de Davis est soutenue par la Fondation Alfred P. Sloan, le Fonds James H. Ferry, la J-Clinic du MIT et la famille Whitehead.
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
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