Summary

Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung

Published: November 10, 2023
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Summary

Die Anwendung von Trägerschichten auf kryogene Elektronenmikroskopie-Gitter (KryoEM) kann die Partikeldichte erhöhen, Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche begrenzen, strahlinduzierte Bewegungen reduzieren und die Verteilung der Partikelorientierungen verbessern. In diesem Artikel wird ein robustes Protokoll für die Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer Monoschicht aus Graphen beschrieben, um die Vorbereitung von Kryoproben zu verbessern.

Abstract

Bei der kryogenen Elektronenmikroskopie (KryoEM) werden gereinigte Makromoleküle auf ein Gitter aufgebracht, das eine löchrige Kohlenstofffolie trägt. Die Moleküle werden dann getupft, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und schnell in einer etwa 20-100 nm dicken Schicht aus glasartigem Eis eingefroren, die über etwa 1 μm breite Folienlöcher schwebt. Die resultierende Probe wird mittels kryogener Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet und nach der Bildverarbeitung mit geeigneter Software können nahezu atomar aufgelöste Strukturen bestimmt werden. Trotz der weit verbreiteten Akzeptanz der KryoEM bleibt die Probenvorbereitung ein schwerwiegender Engpass in den Arbeitsabläufen der KryoEM, wobei die Anwender oft auf Herausforderungen stoßen, die mit dem schlechten Verhalten von Proben im schwebenden Glaseis zusammenhängen. In jüngster Zeit wurden Methoden entwickelt, um KryoEM-Gitter mit einer einzigen kontinuierlichen Schicht aus Graphen zu modifizieren, die als Stützfläche fungiert, die oft die Partikeldichte im abgebildeten Bereich erhöht und Wechselwirkungen zwischen Partikeln und der Luft-Wasser-Grenzfläche reduzieren kann. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Anwendung von Graphen auf KryoEM-Gitter und für die schnelle Bewertung der relativen Hydrophilie der resultierenden Gitter zur Verfügung. Darüber hinaus beschreiben wir eine EM-basierte Methode, um das Vorhandensein von Graphen zu bestätigen, indem wir sein charakteristisches Beugungsmuster visualisieren. Schließlich demonstrieren wir den Nutzen dieser Graphenträger, indem wir eine Dichtekarte mit einer Auflösung von 2,7 Å eines Cas9-Komplexes unter Verwendung einer reinen Probe in relativ niedriger Konzentration schnell rekonstruieren.

Introduction

Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) hat sich zu einer weit verbreiteten Methode zur Visualisierung biologischer Makromoleküle entwickelt1. Angetrieben von Fortschritten bei der direkten Elektronendetektion 2,3,4, der Datenerfassung5 und den Bildverarbeitungsalgorithmen 6,7,8,9,10 ist die KryoEM nun in der Lage, 3D-Strukturen mit nahezu atomarer Auflösung einer schnell wachsenden Anzahl von Makromolekülenzu erzeugen 11. Darüber hinaus können Benutzer durch die Nutzung der Einzelmolekülnatur des Ansatzes mehrere Strukturen aus einer einzigen Probe 12,13,14,15 bestimmen, was das Versprechen unterstreicht, die generierten Daten zum Verständnis heterogener Strukturensembles 16,17 zu verwenden. Trotz dieser Fortschritte gibt es nach wie vor Engpässe bei der Gittervorbereitung von Kryoproben.

Für die strukturelle Charakterisierung mittels KryoEM sollten biologische Proben gut in wässriger Lösung dispergiert und dann durch einen Prozess namens Vitrifikation18,19 schockgefroren werden. Das Ziel ist es, Partikel in einer gleichmäßig dünnen Schicht aus verglastem Eis einzufangen, die über regelmäßig verteilte Löcher hängt, die normalerweise in eine Schicht aus amorphem Kohlenstoff geschnitten sind. Diese gemusterte amorphe Kohlenstofffolie wird von einem TEM-Gitter getragen, das ein Netz aus Kupfer- oder Goldstützstäben trägt. In Standardarbeitsabläufen werden die Gitter vor dem Auftragen der Probe durch eine Glimmentladungsplasmabehandlung hydrophil gemacht. Überschüssige Flüssigkeit wird mit Filterpapier abgetupft, so dass die Proteinlösung einen dünnen Flüssigkeitsfilm über die Löcher bilden kann, der beim Eintauchen leicht vitrifiziert werden kann. Zu den allgemeinen Herausforderungen gehören die Lokalisierung von Partikeln an der Luft-Wasser-Grenzfläche (AWI) und die anschließende Denaturierung 20,21,22 oder die Annahme bevorzugter Orientierungen 23,24,25, die Anhaftung der Partikel an der Kohlenstofffolie, anstatt in die Löcher zu wandern, sowie die Clusterbildung und Aggregation der Partikel innerhalb der Löcher26. Eine ungleichmäßige Eisdicke ist ein weiteres Problem. Dickes Eis kann aufgrund erhöhter Elektronenstreuung zu einem höheren Hintergrundrauschen in den Schliffbildern führen, während extrem dünnes Eis größere Partikel ausschließen kann27.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wurde eine Vielzahl dünner Trägerfilme verwendet, um Gitteroberflächen zu beschichten, so dass Partikel auf diesen Trägern ruhen können und im Idealfall Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche vermieden werden. Graphenträger haben sich als sehr vielversprechend erwiesen, zum Teil aufgrund ihrer hohen mechanischen Festigkeit in Verbindung mit ihrem minimalen Streuquerschnitt, der das von der Trägerschicht28 hinzugefügte Hintergrundsignal reduziert. Neben seinem minimalen Beitrag zum Hintergrundrauschen weist Graphen auch eine bemerkenswerte elektrische und thermische Leitfähigkeitauf 29. Es hat sich gezeigt, dass mit Graphen und Graphenoxid beschichtete Gitter eine höhere Partikeldichte, eine gleichmäßigere Partikelverteilung30 und eine geringere Lokalisierung zum AWI22 aufweisen. Darüber hinaus bietet Graphen eine Trägeroberfläche, die weiter modifiziert werden kann, um: 1) die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Gitteroberfläche durch Funktionalisierung31, 32, 33 abzustimmen; oder 2) Kopplungsverbindungsmittel, die die Affinitätsreinigung von Proteinen von Interesse erleichtern 34,35,36.

In diesem Artikel haben wir ein bestehendes Verfahren zur Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer einzigen gleichmäßigen Schicht aus Graphen30 modifiziert. Die Modifikationen zielen darauf ab, die Netzhandhabung im gesamten Protokoll zu minimieren, mit dem Ziel, die Ausbeute und Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Darüber hinaus diskutieren wir unseren Ansatz zur Bewertung der Wirksamkeit verschiedener UV/Ozon-Behandlungen, um Gitter vor dem Eintauchen hydrophil zu machen. Dieser Schritt bei der KryoEM-Probenvorbereitung mit graphenbeschichteten Gittern ist von entscheidender Bedeutung, und wir haben festgestellt, dass unsere einfache Methode zur Quantifizierung der relativen Hydrophilie der resultierenden Gitter nützlich ist. Mit diesem Protokoll demonstrieren wir den Nutzen der Verwendung von Graphen-beschichteten Gittern zur Strukturaufklärung, indem wir eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion von katalytisch inaktivem S. pyogenes Cas9 im Komplex mit Guide-RNA und Ziel-DNA erstellen.

Protocol

1. Herstellung von CVD-Graphen Bereiten Sie die Graphenätzlösung wie unten beschrieben vor.4,6 g Ammoniumpersulfat (APS) in 20 ml Wasser in molekularer Qualität in einem 50-ml-Becherglas für eine 1-m-Lösung auflösen und mit Aluminiumfolie abdecken. Lassen Sie APS vollständig auflösen, während Sie mit Schritt 1.2 fortfahren. Bereiten Sie einen Abschnitt CVD-Graphen für die Methylmethacrylat-Beschichtung (MMA) vor. Schneiden Sie vorsichtig einen quadratisch…

Representative Results

Die erfolgreiche Herstellung von graphenbeschichteten KryoEM-Gittern unter Verwendung der hier beschriebenen Ausrüstung (Abbildung 1) und des Protokolls (Abbildung 2) führt zu einer Monoschicht aus Graphen, die die Folienlöcher bedeckt, was durch ihr charakteristisches Beugungsmuster bestätigt werden kann. Um die Proteinadsorption an die Graphenoberfläche zu fördern, kann die Oberfläche durch UV/Ozon-Behandlung hydrophil gemacht werden, indem sauerstoffha…

Discussion

Die CryoEM-Probenvorbereitung bringt eine Vielzahl technischer Herausforderungen mit sich, wobei die meisten Arbeitsabläufe erfordern, dass Forscher zerbrechliche Gitter manuell mit äußerster Sorgfalt manipulieren, um sie nicht zu beschädigen. Darüber hinaus ist die Zugänglichkeit einer Probe für die Vitrifikation unvorhersehbar; Partikel interagieren häufig mit der Luft-Wasser-Grenzfläche oder mit der festen Trägerfolie, die die Gitter überlagert, was dazu führen kann, dass Partikel bevorzugte Orientierungen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Proben wurden in der CryoEM Facility in MIT.nano mit Mikroskopen präpariert und abgebildet, die dank der Arnold and Mabel Beckman Foundation erworben wurden. Kontaktwinkel-Bildgebungsgeräte wurden im MIT Metropolis Maker Space gedruckt. Wir danken den Laboren von Nieng Yan und Yimo Han sowie den Mitarbeitern von MIT.nano für ihre Unterstützung bei der Einführung dieser Methode. Insbesondere danken wir Dr. Guanhui Gao und Dr. Sarah Sterling für ihre aufschlussreichen Diskussionen und ihr Feedback. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01-GM144542, 5T32-GM007287 und NSF-CAREER-Zuschüsse 2046778 unterstützt. Die Forschung im Davis-Labor wird von der Alfred P. Sloan Foundation, dem James H. Ferry Fund, der MIT J-Clinic und der Whitehead Family unterstützt.

Materials

250 mL beaker (3x) Fisher 02-555-25B
50 mL beaker (2x) Corning 1000-50
Acetone Fisher A949-4
Aluminum foil Fisher 15-078-292
Ammonium persulfate Fisher (I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm Mattek PCS-1.5-5024
CVD graphene Graphene Supermarket CVD-Cu-2×2
easiGlow discharger Ted-Pella 91000S
Ethanol Millipore-Sigma 1.11727
Flat-tip tweezers  Fisher 50-239-60
Glass cutter Grainger 21UE26
Glass petri plate and cover  VWR 75845-544
Glass serological pipette Fisher 13-676-34D
Grid Storage Case EMS 71146-02
Hot plate Fisher 07-770-108
Isopropanol Sigma W292907
Kimwipe Fisher 06-666
Lab scissors  Fisher 13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6  Kayaku MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water Corning 46-000-CM
Negative action tweezers (2x) Fisher 50-242-78
P20 pipette Rainin 17014392
P200 pipette Rainin 17008652 
Parafilm Fisher 13-374-12
Pipette tips Rainin 30389291
Quantifoil grids with holey carbon  EMS Q2100CR1
Spin coater  SetCas KW-4A with chuck SCA-19-23
Straightedge ULINE H-6560
Thermometer  Grainger 3LRD1
UV/Ozone cleaner  BioForce SKU: PC440
Vacuum desiccator Thomas Scientific 1159X11
Whatman paper VWR 28297-216

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Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, J. H. Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination. J. Vis. Exp. (201), e66023, doi:10.3791/66023 (2023).

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