Applicazione del grafene monostrato alle griglie di microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione
Summary
L’applicazione di strati di supporto alle griglie di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) può aumentare la densità delle particelle, limitare le interazioni con l’interfaccia aria-acqua, ridurre il movimento indotto dal fascio e migliorare la distribuzione degli orientamenti delle particelle. Questo documento descrive un solido protocollo per il rivestimento delle griglie crioEM con un monostrato di grafene per una migliore preparazione del campione criogenico.
Abstract
Nella microscopia elettronica criogenica (cryoEM), le macromolecole purificate vengono applicate a una griglia contenente una lamina di carbonio bucata; Le molecole vengono quindi tamponate per rimuovere il liquido in eccesso e congelate rapidamente in uno strato di ghiaccio vetroso spesso circa 20-100 nm, sospeso su fori di lamina larghi circa 1 μm. Il campione risultante viene ripreso utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione criogenica e, dopo l’elaborazione dell’immagine utilizzando un software adatto, è possibile determinare strutture a risoluzione quasi atomica. Nonostante l’adozione diffusa di cryoEM, la preparazione dei campioni rimane un grave collo di bottiglia nei flussi di lavoro di cryoEM, con gli utenti che spesso incontrano sfide legate ai campioni che si comportano male nel ghiaccio vitreo sospeso. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per modificare le griglie crioEM con un singolo strato continuo di grafene, che funge da superficie di supporto che spesso aumenta la densità delle particelle nell’area ripresa e può ridurre le interazioni tra le particelle e l’interfaccia aria-acqua. Qui, forniamo protocolli dettagliati per l’applicazione del grafene alle griglie crioEM e per valutare rapidamente l’idrofilia relativa delle griglie risultanti. Inoltre, descriviamo un metodo basato su EM per confermare la presenza di grafene visualizzando il suo caratteristico modello di diffrazione. Infine, dimostriamo l’utilità di questi supporti di grafene ricostruendo rapidamente una mappa di densità con risoluzione di 2,7 Å di un complesso Cas9 utilizzando un campione puro a una concentrazione relativamente bassa.
Introduction
La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) si è evoluta in un metodo ampiamente utilizzato per la visualizzazione di macromolecole biologiche1. Alimentata dai progressi nel rilevamento diretto degli elettroni 2,3,4, nell’acquisizione dati5 e negli algoritmi di elaborazione delle immagini 6,7,8,9,10, la crioEM è ora in grado di produrre strutture 3D a risoluzione quasi atomica di un numero in rapida crescita di macromolecole11. Inoltre, sfruttando la natura a singola molecola dell’approccio, gli utenti possono determinare strutture multiple da un singolo campione 12,13,14,15, evidenziando la promessa di utilizzare i dati generati per comprendere insiemi strutturali eterogenei 16,17. Nonostante questi progressi, persistono colli di bottiglia nella preparazione della griglia dei campioni criogenici.
Per la caratterizzazione strutturale mediante crioEM, i campioni biologici devono essere ben dispersi in soluzione acquosa e quindi devono essere congelati attraverso un processo chiamato vetrificazione18,19. L’obiettivo è quello di catturare le particelle in uno strato uniformemente sottile di ghiaccio vetrificato sospeso attraverso fori regolarmente distanziati che sono tipicamente tagliati in uno strato di carbonio amorfo. Questa lamina di carbonio amorfo modellata è supportata da una griglia TEM che porta una maglia di barre di supporto in rame o oro. Nei flussi di lavoro standard, le griglie vengono rese idrofile utilizzando un trattamento al plasma a scarica luminosa prima dell’applicazione del campione. Il liquido in eccesso viene tamponato con carta da filtro, consentendo alla soluzione proteica di formare un sottile film liquido attraverso i fori che può essere prontamente vetrificato durante il surgelaggio. Le sfide più comuni includono la localizzazione delle particelle all’interfaccia aria-acqua (AWI) e la successiva denaturazione20,21,22 o l’adozione di orientamenti preferenziali 23,24,25, l’aderenza delle particelle alla lamina di carbonio piuttosto che migrare nei fori e il raggruppamento e l’aggregazione delle particelle all’interno dei fori 26. Lo spessore non uniforme del ghiaccio è un’altra preoccupazione; Il ghiaccio spesso può provocare livelli più elevati di rumore di fondo nelle micrografie a causa dell’aumento della dispersione di elettroni, mentre il ghiaccio estremamente sottile può escludere particelle più grandi27.
Per affrontare queste sfide, è stata utilizzata una varietà di sottili film di supporto per rivestire le superfici della griglia, consentendo alle particelle di riposare su questi supporti e, idealmente, evitare interazioni con l’interfaccia aria-acqua. I supporti in grafene si sono dimostrati molto promettenti, in parte grazie alla loro elevata resistenza meccanica unita alla loro minima sezione trasversale di scattering, che riduce il segnale di fondo aggiunto dallo strato di supporto28. Oltre al suo contributo minimo al rumore di fondo, il grafene presenta anche una notevole conduttività elettrica e termica29. È stato dimostrato che le griglie rivestite di grafene e ossido di grafene producono una maggiore densità di particelle, una distribuzione più uniforme delle particelle30 e una localizzazione ridotta all’AWI22. Inoltre, il grafene fornisce una superficie di supporto che può essere ulteriormente modificata per: 1) regolare le proprietà fisico-chimiche della superficie della griglia attraverso la funzionalizzazione 31,32,33; o 2) agenti leganti di coppia che facilitano la purificazione di affinità delle proteine di interesse 34,35,36.
In questo articolo, abbiamo modificato una procedura esistente per il rivestimento delle griglie cryoEM con un singolo strato uniforme di grafene30. Le modifiche mirano a ridurre al minimo la gestione della rete in tutto il protocollo, con l’obiettivo di aumentare la resa e la riproducibilità. Inoltre, discutiamo il nostro approccio per valutare l’efficacia di vari trattamenti UV/ozono nel rendere idrofile le griglie prima dell’immersione. Questa fase della preparazione dei campioni crioEM utilizzando griglie rivestite di grafene è fondamentale e abbiamo trovato utile il nostro metodo semplice per quantificare l’idrofilia relativa delle griglie risultanti. Utilizzando questo protocollo, dimostriamo l’utilità dell’impiego di griglie rivestite di grafene per la determinazione della struttura generando una ricostruzione 3D ad alta risoluzione di S. pyogenes Cas9 cataliticamente inattivo in complesso con RNA guida e DNA bersaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparazione dei campioni CryoEM comporta una serie di sfide tecniche, con la maggior parte dei flussi di lavoro che richiedono ai ricercatori di manipolare manualmente le griglie fragili con estrema cura per evitare di danneggiarle. Inoltre, l’idoneità di qualsiasi campione alla vetrificazione è imprevedibile; Le particelle spesso interagiscono con l’interfaccia aria-acqua o con la lamina di supporto solida che si sovrappone alle griglie, il che può portare le particelle ad adottare gli orientamenti preferiti o a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I campioni sono stati preparati e sottoposti a imaging presso la CryoEM Facility di MIT.nano su microscopi acquisiti grazie alla Arnold and Mabel Beckman Foundation. I dispositivi di imaging dell’angolo di contatto sono stati stampati presso il Metropolis Maker Space del MIT. Ringraziamo i laboratori di Nieng Yan e Yimo Han e il personale del MIT.nano per il loro supporto durante l’adozione di questo metodo. In particolare, estendiamo i nostri ringraziamenti alle dottoresse Guanhui Gao e Sarah Sterling per le loro approfondite discussioni e feedback. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 e NSF-CAREER grant 2046778. La ricerca nel laboratorio di Davis è sostenuta dalla Alfred P. Sloan Foundation, dal James H. Ferry Fund, dalla MIT J-Clinic e dalla Whitehead Family.
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
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