تطبيق الجرافين أحادي الطبقة على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد لتحديد الهيكل عالي الدقة
Summary
يمكن أن يؤدي تطبيق طبقات الدعم على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) إلى زيادة كثافة الجسيمات ، والحد من التفاعلات مع واجهة الهواء والماء ، وتقليل الحركة التي يسببها الحزمة ، وتحسين توزيع اتجاهات الجسيمات. تصف هذه الورقة بروتوكولا قويا لطلاء شبكات cryoEM بطبقة أحادية من الجرافين لتحسين تحضير عينة التبريد.
Abstract
في المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) ، يتم تطبيق الجزيئات الكبيرة المنقاة على شبكة تحمل رقائق كربون هولي. ثم يتم تنظيف الجزيئات لإزالة السائل الزائد وتجميدها بسرعة في طبقة سميكة من الجليد الزجاجي بسمك 20-100 نانومتر تقريبا ، معلقة عبر ثقوب رقائق بعرض 1 ميكرومتر تقريبا. يتم تصوير العينة الناتجة باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد ، وبعد معالجة الصور باستخدام برنامج مناسب ، يمكن تحديد هياكل الدقة شبه الذرية. على الرغم من اعتماد cryoEM على نطاق واسع ، لا يزال تحضير العينات يمثل عنق زجاجة شديد في سير عمل cryoEM ، حيث يواجه المستخدمون غالبا تحديات تتعلق بالعينات التي تتصرف بشكل سيئ في الجليد الزجاجي المعلق. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق لتعديل شبكات cryoEM بطبقة واحدة مستمرة من الجرافين ، والتي تعمل كسطح دعم يزيد غالبا من كثافة الجسيمات في المنطقة المصورة ويمكن أن يقلل من التفاعلات بين الجسيمات وواجهة الهواء والماء. هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لتطبيق الجرافين على شبكات cryoEM وللتقييم السريع للمحبة المائية النسبية للشبكات الناتجة. بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة قائمة على EM لتأكيد وجود الجرافين من خلال تصور نمط الحيود المميز. أخيرا ، نوضح فائدة دعامات الجرافين هذه من خلال إعادة بناء خريطة كثافة دقة 2.7 Å لمجمع Cas9 بسرعة باستخدام عينة نقية بتركيز منخفض نسبيا.
Introduction
تطور المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيم (cryoEM) إلى طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتصور الجزيئات البيولوجيةالكبيرة 1. مدعوما بالتقدم في الكشف المباشر عن الإلكترون2،3،4 ، والحصول على البيانات5 ، وخوارزميات معالجة الصور6،7،8،9،10 ، أصبح cryoEM الآن قادرا على إنتاج هياكل ثلاثية الأبعاد قريبة من الدقة الذرية لعدد متزايد بسرعة من الجزيئاتالكبيرة 11. علاوة على ذلك ، من خلال الاستفادة من طبيعة الجزيء الواحد للنهج ، يمكن للمستخدمين تحديد هياكل متعددة من عينة واحدة12،13،14،15 ، مما يسلط الضوء على الوعد باستخدام البيانات التي تم إنشاؤها لفهم المجموعات الهيكلية غير المتجانسة16,17. على الرغم من هذا التقدم ، لا تزال الاختناقات في إعداد شبكة العينات المبردة قائمة.
للتوصيف الهيكلي بواسطة cryoEM ، يجب أن تكون العينات البيولوجية مشتتة جيدا في محلول مائي ثم يجب تجميدها بسرعة من خلال عملية تسمى التزجيج 18,19. الهدف هو التقاط الجسيمات في طبقة رقيقة بشكل موحد من الجليد المزجج المعلق عبر ثقوب متباعدة بانتظام والتي يتم قطعها عادة إلى طبقة من الكربون غير المتبلور. يتم دعم رقائق الكربون غير المتبلورة المزخرفة هذه بواسطة شبكة TEM تحمل شبكة من قضبان دعم النحاس أو الذهب. في سير العمل القياسي ، يتم تقديم الشبكات محبة للماء باستخدام معالجة بلازما متوهجة التفريغ قبل تطبيق العينة. يتم تنظيف السائل الزائد بورق الترشيح ، مما يسمح لمحلول البروتين بتكوين طبقة سائلة رقيقة عبر الثقوب التي يمكن تزجيجها بسهولة أثناء تجميد الغطس. تشمل التحديات الشائعة توطين الجسيمات إلى واجهة الهواء والماء (AWI) والتمسخ اللاحق20،21،22 أو اعتماد الاتجاهات المفضلة23،24،25 ، والتزام الجسيمات برقائق الكربون بدلا من الهجرة إلى الثقوب ، وتجميع وتجميع الجسيمات داخل الثقوب26. سمك الجليد غير المنتظم هو مصدر قلق آخر. يمكن أن يؤدي الجليد السميك إلى مستويات أعلى من ضوضاء الخلفية في الصور المجهرية بسبب زيادة تشتت الإلكترون ، في حين أن الجليد الرقيق للغاية يمكن أن يستبعد الجسيمات الأكبر27.
لمواجهة هذه التحديات ، تم استخدام مجموعة متنوعة من أغشية الدعم الرقيقة لطلاء أسطح الشبكة ، مما يسمح للجزيئات بالراحة على هذه الدعامات ، ومن الناحية المثالية ، تجنب التفاعلات مع واجهة الهواء والماء. أظهرت دعامات الجرافين وعدا كبيرا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى قوتها الميكانيكية العالية إلى جانب الحد الأدنى من المقطع العرضي للتشتت ، مما يقلل من إشارة الخلفية التي تضيفها طبقة الدعم28. بالإضافة إلى الحد الأدنى من مساهمته في ضوضاء الخلفية ، يظهر الجرافين أيضا موصلية كهربائية وحراريةملحوظة 29. لقد ثبت أن الشبكات المطلية بالجرافين وأكسيد الجرافين تنتج كثافة جسيمات أعلى ، وتوزيع جسيمات أكثر اتساقا30 ، وتقلل من التوطين إلى AWI22. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر الجرافين سطح دعم يمكن تعديله بشكل أكبر من أجل: 1) ضبط الخصائص الفيزيائية والكيميائية لسطح الشبكة من خلال التشغيلالوظيفي 31،32،33 ؛ أو 2) عوامل ربط الزوجين التي تسهل تنقية تقارب البروتينات ذات الأهمية34،35،36.
في هذه المقالة ، قمنا بتعديل إجراء موجود لطلاء شبكات cryoEM بطبقة موحدة واحدة من الجرافين30. تهدف التعديلات إلى تقليل معالجة الشبكة في جميع أنحاء البروتوكول ، بهدف زيادة العائد وقابلية التكاثر. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش نهجنا لتقييم فعالية علاجات الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون المختلفة في جعل الشبكات محبة للماء قبل الغرق. تعد هذه الخطوة في تحضير عينة cryoEM باستخدام الشبكات المطلية بالجرافين أمرا بالغ الأهمية ، وقد وجدنا أن طريقتنا المباشرة لتحديد المحبة المائية النسبية للشبكات الناتجة مفيدة. باستخدام هذا البروتوكول ، نوضح فائدة استخدام الشبكات المطلية بالجرافين لتحديد الهيكل من خلال توليد إعادة بناء 3D عالية الدقة ل S. pyogenes Cas9 غير النشط تحفيزيا في مجمع مع توجيه الحمض النووي الريبي والحمض النووي المستهدف.
Protocol
Representative Results
Discussion
ينطوي تحضير عينات CryoEM على مجموعة من التحديات التقنية، حيث تتطلب معظم مهام سير العمل من الباحثين التعامل يدويا مع الشبكات الهشة بعناية فائقة لتجنب إتلافها. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن التنبؤ بقابلية أي عينة للتزجيج ؛ غالبا ما تتفاعل الجسيمات مع واجهة الهواء والماء أو مع رقائق الدعم الصلبة ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إعداد العينات وتصويرها في مرفق CryoEM في MIT.nano على المجاهر التي تم الحصول عليها بفضل مؤسسة أرنولد ومابل بيكمان. تمت طباعة أجهزة تصوير زاوية الاتصال في MIT Metropolis Maker Space. نشكر مختبرات Nieng Yan و Yimo Han ، والموظفين في MIT.nano على دعمهم طوال اعتماد هذه الطريقة. على وجه الخصوص ، نعرب عن شكرنا للدكتورين Guanhui Gao و Sarah Sterling على مناقشاتهما الثاقبة وتعليقاتهما. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01-GM144542 و 5T32-GM007287 و NSF-CAREER 2046778 المنح. يتم دعم الأبحاث في مختبر ديفيس من قبل مؤسسة ألفريد بي سلون ، وصندوق جيمس إتش فيري ، وعيادة MIT J-Clinic ، وعائلة وايتهيد.
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
- Dubochet, J. Cryo-EM–the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
