単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用

単粒子極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、生体高分子を可視化するために広く使用されている方法に進化しました¹。直接電子検出 ^2,3,4、データ取得⁵、画像処理アルゴリズム ^6,7,8,9,10 の進歩により、クライオ電子顕微鏡は、急速に増加する高分子の原子分解能に近い分解能の 3D 構造を生成できるようになりました ¹¹.さらに、このアプローチの単一分子の性質を活用することにより、ユーザーは単一のサンプルから複数の構造を決定することができ^{12、13、14、15}、生成されたデータを使用して不均一な構造アンサンブルを理解することの有望性を強調しています^16、17。このような進歩にもかかわらず、クライオ試料グリッド調製のボトルネックは続いています。

クライオ電子顕微鏡による構造特性評価では、生体試料を水溶液に十分に分散させた後、ガラス固化と呼ばれるプロセスで瞬間凍結する必要があります^18,19。目標は、通常はアモルファス炭素の層に切り込まれた等間隔の穴に懸濁したガラス化氷の均一な薄層に粒子を捕捉することです。このパターン化されたアモルファスカーボン箔は、銅または金の支持棒のメッシュを支持するTEMグリッドによって支持されています。標準的なワークフローでは、グリッドは、サンプルを塗布する前にグロー放電プラズマ処理を使用して親水性になります。余分な液体は濾紙で吸い取られ、タンパク質溶液が穴を横切って薄い液体膜を形成し、プランジ凍結中に容易にガラス化できます。一般的な課題には、空気水界面(AWI)への粒子の局在化とそれに続く変性^20,21,22または好ましい配向の採用23,24,25、粒子の穴内への移動ではなく炭素箔への付着、および穴内の粒子のクラスタリングと凝集²⁶が含まれます.不均一な氷の厚さも懸念事項です。厚い氷は、電子散乱の増加により顕微鏡写真のバックグラウンドノイズのレベルが高くなる可能性がありますが、極端に薄い氷はより大きな粒子を排除する可能性があります²⁷。

これらの課題に対処するために、さまざまな薄いサポートフィルムを使用してグリッド表面をコーティングし、粒子をこれらのサポートに乗せ、理想的には空気と水の界面との相互作用を回避できるようにしています。グラフェン支持体は、部分的には、その高い機械的強度と、支持体層²⁸によって付加されるバックグラウンド信号を低減する最小の散乱断面積と相まって、大きな有望性を示している。グラフェンは、バックグラウンドノイズへの寄与が最小限であることに加えて、顕著な電気伝導率と熱伝導率も示します²⁹。グラフェンおよび酸化グラフェンでコーティングされたグリッドは、より高い粒子密度、より均一な粒子分布³⁰、および^AWI22への局在の減少をもたらすことが示されている。さらに、グラフェンは、さらに次のように修飾することができる支持表面を提供する:1)官能基化^31,32,33を通じてグリッド表面の物理化学的特性を調整する。または2)目的のタンパク質の親和性精製を促進する結合剤^34,35,36。

本稿では、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェン³⁰の単一の均一な層でコーティングするための既存の手順を変更しました。この変更は、歩留まりと再現性の向上を目的として、プロトコル全体でグリッド処理を最小限に抑えることを目的としています。さらに、プランジング前にグリッドを親水性にする際のさまざまなUV/オゾン処理の有効性を評価するためのアプローチについても説明します。グラフェンでコーティングされたグリッドを用いたクライオ電子顕微鏡サンプル調製のこのステップは重要であり、得られたグリッドの相対的な親水性を定量化する簡単な方法が有用であることがわかりました。このプロトコルを用いて、ガイドRNAおよび標的DNAとの複合体において、触媒的に不活性な 化膿菌 Cas9の高解像度3D再構成を生成することにより、構造決定にグラフェンコーティングされたグリッドを採用することの有用性を実証します。