Aplicação do Grafeno Monocamada em Grades de Microscopia Crio-Eletrônica para Determinação de Estruturas de Alta Resolução
Summary
A aplicação de camadas de suporte a grades de microscopia eletrônica criogênica (crioEM) pode aumentar a densidade de partículas, limitar as interações com a interface ar-água, reduzir o movimento induzido pelo feixe e melhorar a distribuição das orientações das partículas. Este artigo descreve um protocolo robusto para o revestimento de grades de crioEM com uma monocamada de grafeno para melhorar a preparação de amostras criogênicas.
Abstract
Na microscopia eletrônica criogênica (crioEM), macromoléculas purificadas são aplicadas a uma grade contendo uma folha de carbono holey; As moléculas são então borrifadas para remover o excesso de líquido e rapidamente congeladas em uma camada de gelo vítreo de aproximadamente 20-100 nm de espessura, suspensas em furos de folha de aproximadamente 1 μm de largura. A amostra resultante é imageada usando microscopia eletrônica de transmissão criogênica e, após o processamento da imagem usando software adequado, estruturas de resolução quase atômica podem ser determinadas. Apesar da adoção generalizada do cryoEM, a preparação de amostras continua sendo um gargalo severo nos fluxos de trabalho do cryoEM, com os usuários frequentemente encontrando desafios relacionados ao comportamento inadequado das amostras no gelo vítreo em suspensão. Recentemente, métodos têm sido desenvolvidos para modificar grades crioEM com uma única camada contínua de grafeno, que atua como uma superfície de suporte que frequentemente aumenta a densidade de partículas na área fotografada e pode reduzir as interações entre partículas e a interface ar-água. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para a aplicação de grafeno em grades crioEM e para avaliar rapidamente a hidrofilicidade relativa das grades resultantes. Adicionalmente, descrevemos um método baseado em ME para confirmar a presença de grafeno visualizando seu padrão de difração característico. Finalmente, demonstramos a utilidade desses suportes de grafeno reconstruindo rapidamente um mapa de densidade de resolução de 2,7 Å de um complexo Cas9 usando uma amostra pura em uma concentração relativamente baixa.
Introduction
A microscopia eletrônica criogênica de partícula única (crioEM) evoluiu para um método amplamente utilizado para visualizar macromoléculas biológicas1. Alimentado pelos avanços na detecção direta de elétrons 2,3,4, aquisição de dados5 e algoritmos de processamento de imagens 6,7,8,9,10, o cryoEM é agora capaz de produzir estruturas 3D de resolução quase atômica de um número crescente de macromoléculas11. Além disso, aproveitando a natureza de molécula única da abordagem, os usuários podem determinar múltiplas estruturas a partir de uma única amostra 12,13,14,15, destacando a promessa de usar os dados gerados para entender conjuntos estruturais heterogêneos 16,17. Apesar desse progresso, persistem gargalos na preparação da grade de crio-espécimes.
Para a caracterização estrutural por crioEM, as amostras biológicas devem ser bem dispersas em solução aquosa e, em seguida, congeladas por meio de um processo denominado vitrificação18,19. O objetivo é capturar partículas em uma camada uniformemente fina de gelo vitrificado, suspensa em buracos regularmente espaçados que normalmente são cortados em uma camada de carbono amorfo. Esta folha de carbono amorfa padronizada é suportada por uma grade TEM com uma malha de barras de suporte de cobre ou ouro. Em fluxos de trabalho padrão, as grades são tornadas hidrofílicas usando um tratamento de plasma de descarga luminosa antes da aplicação da amostra. O excesso de líquido é borrado com papel de filtro, permitindo que a solução proteica forme uma fina película líquida através dos orifícios que pode ser facilmente vitrificada durante o congelamento por imersão. Desafios comuns incluem a localização das partículas para a interface ar-água (AWI) e subsequente desnaturação20,21,22 ou a adoção de orientações preferenciais 23,24,25, a aderência das partículas à folha de carbono em vez de migrar para os orifícios e o agrupamento e agregação das partículas dentro dos orifícios26. A espessura não uniforme do gelo é outra preocupação; gelo espesso pode resultar em níveis mais altos de ruído de fundo nas micrografias devido ao aumento do espalhamento de elétrons, enquanto gelo extremamente fino pode excluir partículas maiores27.
Para enfrentar esses desafios, uma variedade de filmes de suporte finos tem sido usada para revestir superfícies de grade, permitindo que as partículas descansem sobre esses suportes e, idealmente, evitem interações com a interface ar-água. Os suportes de grafeno têm se mostrado muito promissores, em parte devido à sua alta resistência mecânica aliada à sua seção transversal de dispersão mínima, o que reduz o sinal de fundo adicionado pela camada de suporte28. Além de sua mínima contribuição para o ruído de fundo, o grafeno também exibe notável condutividade elétrica e térmica29. Grades revestidas com grafeno e óxido de grafeno mostraram maior densidade de partículas, distribuição de partículas mais uniforme30 e localização reduzida para o AWI22. Além disso, o grafeno fornece uma superfície de suporte que pode ser modificada para: 1) sintonizar as propriedades físico-químicas da superfície da grade através da funcionalização 31,32,33; ou 2) agentes ligantes de casal que facilitam a purificação por afinidade de proteínas de interesse 34,35,36.
Neste artigo, modificamos um procedimento existente para o revestimento de grades crioEM com uma única camada uniforme de grafeno30. As modificações visam minimizar o manuseio da grade ao longo do protocolo, com o objetivo de aumentar o rendimento e a reprodutibilidade. Adicionalmente, discutimos nossa abordagem para avaliar a eficácia de vários tratamentos UV/ozônio em tornar as grades hidrofílicas antes do mergulho. Esta etapa na preparação de amostras de crioEM usando grades revestidas com grafeno é crítica, e achamos que nosso método simples para quantificar a hidrofilicidade relativa das grades resultantes é útil. Usando este protocolo, demonstramos a utilidade de empregar grades revestidas com grafeno para a determinação de estruturas, gerando uma reconstrução 3D de alta resolução de S. pyogenes Cas9 cataliticamente inativo em complexo com RNA guia e DNA-alvo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A preparação de amostras CryoEM envolve uma série de desafios técnicos, com a maioria dos fluxos de trabalho exigindo que os pesquisadores manipulem manualmente grades frágeis com extremo cuidado para evitar danificá-las. Além disso, a possibilidade de qualquer amostra ser vitrificação é imprevisível; As partículas frequentemente interagem com a interface ar-água ou com a folha de suporte sólida que sobrepõe as grades, o que pode levar as partículas a adotarem orientações preferenciais ou a não entrare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os espécimes foram preparados e fotografados no CryoEM Facility em MIT.nano em microscópios adquiridos graças à Fundação Arnold e Mabel Beckman. Dispositivos de imagem de ângulo de contato foram impressos no MIT Metropolis Maker Space. Agradecemos aos laboratórios de Nieng Yan e Yimo Han, e à equipe do MIT.nano por seu apoio durante toda a adoção deste método. Em particular, estendemos nossos agradecimentos aos Drs. Guanhui Gao e Sarah Sterling por suas discussões perspicazes e feedback. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 e 2046778 de bolsas NSF-CAREER. A pesquisa no laboratório Davis é apoiada pela Fundação Alfred P. Sloan, pelo James H. Ferry Fund, pelo MIT J-Clinic e pela Família Whitehead.
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
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