Identificación del tipo de fibra del músculo esquelético humano

El músculo esquelético es un tejido heterogéneo, con distintas propiedades celulares metabólicas y contráctiles que dependen de si la célula (fibra) es de contracción lenta (tipo I) o de contracción rápida (tipo II). El tipo de fibra se puede identificar examinando las isoformas de la cadena pesada de miosina (MHC), que difieren entre sí de varias maneras, incluido el tiempo de contracción, la velocidad de acortamiento y la resistencia a la fatiga¹. Las principales isoformas del MHC incluyen el tipo I, el tipo IIa, el tipo IIb y el tipo IIx, y sus perfiles metabólicos son oxidativos (tipo I y IIa) o glucolíticos (IIx, IIb)¹. La proporción de estos tipos de fibra varía según el tipo de músculo y entre especies. El tipo IIb se encuentra ampliamente en el músculo de los roedores. Los músculos humanos no contienen fibras de tipo IIb y consisten predominantemente en isoformas MHC de fibras de tipo I y IIa, con una pequeña proporción de fibras IIx². Los perfiles de expresión de proteínas varían entre los diferentes tipos de fibra y pueden alterarse con el envejecimiento³, el ejercicio ^4,5 y la enfermedad 6.

La medición de las respuestas celulares en diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas a menudo se pasa por alto o no es posible debido al examen de los homogeneizados musculares (una mezcla de todos los tipos de fibras). El Western blot de una sola fibra permite la investigación de múltiples proteínas en fibras musculares individuales⁷. Esta metodología se ha utilizado previamente para producir características novedosas e informativas de una sola fibra que no eran posibles de obtener utilizando preparaciones homogeneizadas. Sin embargo, existen algunas limitaciones de la metodología original de Western blot de una sola fibra, incluida la naturaleza que consume mucho tiempo, la incapacidad de generar réplicas de muestras y el uso de reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) costosos y sensibles. Si se utiliza tejido fresco, este método se limita aún más debido a las limitaciones de tiempo de la necesidad de aislar fibras individuales dentro de un período de tiempo limitado (es decir, 1-2 h). Afortunadamente, esta restricción se mitiga aislando segmentos de una sola fibra del tejido liofilizado⁸. Sin embargo, la recolección de fibras de muestras liofilizadas está limitada por el tamaño y la calidad del tejido biopsiado.

La identificación del tipo de fibra mediante el método de transferencia de puntos⁹ se ha desarrollado y ampliado significativamente en este protocolo integral. Anteriormente, se ha demostrado que tan solo ~ 2-10 mg de tejido muscular de peso húmedo es adecuado para la liofilización y el análisis de proteínas isoformadas de MHC de fibra^{única 9}. Christensen et ^al.9 utilizaron el 30% de un segmento de fibra de ~1 mm para detectar la isoforma MHC presente por transferencia de puntos, lo que se confirmó mediante Western blot. Este trabajo mostró que al sustituir la Western blot por la transferencia de puntos, los costos generales se redujeron en ~ 40 veces (para 50 segmentos de fibra). A continuación, las fibras se “agruparon” en muestras de tipo I y II, lo que permitió la replicación experimental⁹. Sin embargo, una limitación fue que solo se obtuvieron dos muestras específicas para cada tipo de fibra: tipo I (fibras MHCI positivas) y tipo II (fibras MHCII positivas), con muestras de tipo II que contenían una mezcla de MHCIIa y MHCIIx ^6,10. En particular, el protocolo actual demuestra cómo se pueden identificar las fibras puras de tipo IIx y proporciona un flujo de trabajo muy detallado (resumido en la Figura 1), incluidas las estrategias de solución de problemas para problemas comunes del protocolo.