Identificação do Tipo de Fibra do Músculo Esquelético Humano
Summary
Este protocolo demonstra o isolamento de fibra única do músculo esquelético humano liofilizado e a classificação do tipo de fibra de acordo com a isoforma da cadeia pesada da miosina (MHC) usando a técnica de dot blotting. Amostras de fibras MHC I e II identificadas podem então ser analisadas para diferenças específicas do tipo de fibra na expressão de proteínas usando western blotting.
Abstract
A técnica aqui descrita pode ser usada para identificar isoformas específicas da cadeia pesada de miosina (MHC) em segmentos de fibras musculares individuais usando dot blotting, doravante referido como detecção de cadeia pesada de Myosin por Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Este protocolo descreve o processo de liofilização do músculo esquelético humano e o isolamento de segmentos de fibras musculares únicas. Usando MyDoBID, as fibras do tipo I e II são classificadas com anticorpos MHCI- e IIa-específicos, respectivamente. As fibras classificadas são então combinadas em amostras específicas do tipo de fibra para cada biópsia.
A proteína total em cada amostra é determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) e tecnologia de gel ativado por UV. O tipo de fibra das amostras é validado usando western blotting. A importância de realizar a normalização da carga proteica para melhorar a detecção de proteínas-alvo em vários western blots também é descrita. Os benefícios da consolidação de fibras classificadas em amostras específicas do tipo de fibra em comparação com as blots ocidentais de fibra única incluem versatilidade da amostra, maior rendimento da amostra, menor investimento de tempo e medidas de economia de custos, tudo isso enquanto retém informações valiosas específicas do tipo de fibra que são frequentemente negligenciadas usando amostras musculares homogeneizadas. O objetivo do protocolo é obter a identificação precisa e eficiente de fibras tipo I e tipo II isoladas de amostras de músculo esquelético humano liofilizado.
Essas fibras individuais são posteriormente combinadas para criar amostras específicas do tipo I e do tipo II de fibras. Além disso, o protocolo é estendido para incluir a identificação de fibras do tipo IIx, usando Actina como marcador para fibras negativas para MHCI e MHCIIa, que são confirmadas como fibras IIx por western blotting. Cada amostra específica do tipo de fibra é então usada para quantificar a expressão de várias proteínas-alvo usando técnicas de western blotting.
Introduction
O músculo esquelético é um tecido heterogêneo, com propriedades metabólicas e contráteis celulares distintas que dependem se a célula (fibra) é de contração lenta (tipo I) ou contração rápida (tipo II). O tipo de fibra pode ser identificado examinando-se as isoformas da cadeia pesada da miosina (MHC), que diferem entre si de várias maneiras, incluindo tempo de contração, velocidade de encurtamento e resistência à fadiga1. As principais isoformas de MHC incluem tipo I, tipo IIa, tipo IIb e tipo IIx e seus perfis metabólicos são oxidativos (tipo I e IIa) ou glicolíticos (IIx, IIb)1. A proporção desses tipos de fibras varia no tipo muscular e entre as espécies. O tipo IIb é amplamente encontrado no músculo de roedores. A musculatura humana não contém fibras do tipo IIb e é constituída predominantemente pelas isoformas MHC do tipo I e IIa, com pequena proporção de fibras IIx2. Os perfis de expressão proteica variam entre os diferentes tipos de fibras e podem ser alterados com o envelhecimento3, exercício 4,5 e doença 6.
A medição das respostas celulares em diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas é frequentemente negligenciada ou não é possível devido ao exame de homogeneizados musculares (uma mistura de todos os tipos de fibras). O western blot de fibra única permite a investigação de múltiplas proteínas em fibras musculares individuais7. Esta metodologia foi previamente utilizada para produzir características novas e informativas de monofibra que não foram possíveis de obter usando preparações homogeneizadas. No entanto, existem algumas limitações da metodologia original de western blot de fibra única, incluindo a natureza demorada, a incapacidade de gerar réplicas de amostra e o uso de reagentes de quimioluminescência aprimorada (ECL) caros e sensíveis. Se o tecido fresco está sendo usado, este método é ainda mais limitado devido às restrições de tempo da necessidade de isolar fibras individuais dentro de um período de tempo limitado (ou seja, 1-2 h). Felizmente, essa restrição é atenuada pelo isolamento de segmentos monofibrosos do tecido liofilizado8. No entanto, a coleta de fibras de amostras liofilizadas é limitada pelo tamanho e qualidade do tecido biopsiado.
A identificação do tipo de fibra usando o método dot blotting9 foi significativamente elaborada e expandida neste protocolo abrangente. Previamente, foi demonstrado que apenas ~2-10 mg de tecido muscular de peso úmido é adequado para liofilização e análise de proteína de isoforma MHC de fibra única9. Christensen et al.9 utilizaram 30% de um segmento de fibra de ~1 mm para detectar a isoforma MHC presente por dot blotting, o que foi confirmado por western blotting. Este trabalho mostrou que, ao substituir o western blotting pelo dot blotting, os custos totais foram reduzidos em ~40 vezes (para 50 segmentos de fibra). As fibras foram então “agrupadas” em amostras do tipo I e tipo II, o que permitiu a replicação experimental9. No entanto, uma limitação foi que apenas duas amostras específicas do tipo de fibra foram obtidas: tipo I (MHCI positivo) e tipo II (MHCII positivo), com amostras do tipo II contendo uma mistura de MHCIIa e MHCIIx 6,10. Notavelmente, o protocolo atual demonstra como as fibras do tipo IIx puras podem ser identificadas e fornece um fluxo de trabalho altamente detalhado (resumido na Figura 1), incluindo estratégias de solução de problemas para problemas comuns de protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Coleção de fibras
Com base em vários anos de experiência, a maioria dos pesquisadores pode dominar essa técnica; no entanto, a prática leva a uma coleta de fibra mais rápida e eficiente para análises a jusante. Para poder isolar 30 segmentos de fibra única de qualidade para pooling, recomenda-se que sejam coletados 50 segmentos de fibra por amostra. Estudar o vídeo de coleta de fibras cuidadosamente e depois de realizar duas sessões de prática (~50 fibras por sessão) é recomendado para a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os anticorpos contra MHC I (A4.840) e MHCIIa (A4.74) utilizados neste estudo foram desenvolvidos pelo Dr. H. M. Blau e o anticorpo contra MHCIIx (6H1) foi desenvolvido pelo Dr. C. A. Lucas e obtido do Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), graças aos auspícios do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas (Iowa City, IA). Agradecemos a Victoria L. Wyckelsma por fornecer as amostras de músculo humano para este estudo. A maioria das imagens da Figura 1 provinha de BioRender.com.
Financiamento:
Este estudo não recebeu financiamento externo.
Materials
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
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