Identification du type de fibre du muscle squelettique humain
Summary
Ce protocole démontre l’isolement d’une seule fibre à partir de muscles squelettiques humains lyophilisés et la classification du type de fibre selon l’isoforme de la chaîne lourde de myosine (CMH) à l’aide de la technique de transfert de points. Les échantillons de fibres CMH I et II identifiés peuvent ensuite être analysés plus en détail pour détecter les différences spécifiques au type de fibre dans l’expression des protéines à l’aide du transfert Western.
Abstract
La technique décrite ici peut être utilisée pour identifier des isoformes spécifiques de la chaîne lourde de myosine (CMH) dans des segments de fibres musculaires individuelles à l’aide du transfert de points, ci-après dénommé détection de la chaîne lourde de l’osine par lotting Dot Bpour l’identificationdu type defibre musculaire (MyDoBID). Ce protocole décrit le processus de lyophilisation des muscles squelettiques humains et l’isolement de segments de fibres musculaires individuelles. À l’aide de MyDoBID, les fibres de type I et II sont classées avec des anticorps spécifiques de l’ICM et de l’IIa, respectivement. Les fibres classées sont ensuite combinées dans des échantillons spécifiques au type de fibre pour chaque biopsie.
La protéine totale dans chaque échantillon est déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) et par la technologie de gel activé par les UV. Le type de fibre des échantillons est validé à l’aide du Western Blot. L’importance d’effectuer la normalisation de la charge protéique pour améliorer la détection des protéines cibles sur plusieurs Western blots est également décrite. Les avantages de la consolidation des fibres classées dans des échantillons spécifiques au type de fibre par rapport aux Western Blots à fibre unique comprennent la polyvalence des échantillons, l’augmentation du débit des échantillons, la réduction de l’investissement en temps et les mesures d’économie, tout en conservant des informations précieuses spécifiques au type de fibre qui sont souvent négligées à l’aide d’échantillons musculaires homogénéisés. L’objectif du protocole est d’obtenir une identification précise et efficace des fibres de type I et de type II isolées à partir d’échantillons de muscles squelettiques humains lyophilisés.
Ces fibres individuelles sont ensuite combinées pour créer des échantillons spécifiques au type de fibre de type I et de type II. De plus, le protocole est étendu pour inclure l’identification des fibres de type IIx, en utilisant l’actine comme marqueur pour les fibres qui étaient négatives pour MHCI et MHCIIa, qui sont confirmées comme des fibres IIx par western blot. Chaque échantillon spécifique au type de fibre est ensuite utilisé pour quantifier l’expression de diverses protéines cibles à l’aide de techniques de transfert Western.
Introduction
Le muscle squelettique est un tissu hétérogène, avec des propriétés métaboliques et contractiles cellulaires distinctes qui dépendent du fait que la cellule (fibre) soit à contraction lente (type I) ou à contraction rapide (type II). Le type de fibre peut être identifié en examinant les isoformes de la chaîne lourde de myosine (CMH), qui diffèrent les unes des autres de plusieurs façons, notamment par le temps de contraction, la vitesse de raccourcissement et la résistance à la fatigue1. Les principales isoformes du CMH comprennent le type I, le type IIa, le type IIb et le type IIx et leurs profils métaboliques sont soit oxydatifs (type I et IIa), soit glycolytiques (IIx, IIb)1. La proportion de ces types de fibres varie selon le type de muscle et d’une espèce à l’autre. Le type IIb est largement présent dans les muscles des rongeurs. Les muscles humains ne contiennent pas de fibres de type IIb et sont principalement constitués de fibres isoformes du CMH de type I et IIa, avec une faible proportion de fibres IIx2. Les profils d’expression des protéines varient selon les différents types de fibres et peuvent être modifiés avec l’âge3, l’exercice 4,5 et la maladie6.
La mesure des réponses cellulaires dans différents types de fibres musculaires squelettiques est souvent négligée ou impossible en raison de l’examen des homogénats musculaires (un mélange de tous les types de fibres). Le western blot à fibre unique permet d’étudier plusieurs protéines dans les fibres musculaires individuelles7. Cette méthodologie a déjà été utilisée pour produire des caractéristiques nouvelles et informatives d’une seule fibre qu’il n’était pas possible d’obtenir en utilisant des préparations homogénatées. Cependant, la méthodologie originale de transfert Western à fibre unique présente certaines limites, notamment la nature chronophage, l’incapacité de générer des répétitions d’échantillons et l’utilisation de réactifs de chimiluminescence améliorée (ECL) coûteux et sensibles. Si des tissus frais sont utilisés, cette méthode est encore plus limitée en raison des contraintes de temps liées à la nécessité d’isoler les fibres individuelles dans un délai limité (c’est-à-dire 1 à 2 h). Heureusement, cette contrainte est atténuée en isolant les segments de fibres simples des tissus lyophilisés8. Cependant, la collecte de fibres à partir d’échantillons lyophilisés est limitée par la taille et la qualité du tissu biopsié.
L’identification du type de fibre à l’aide de la méthode de transfert de points9 a été considérablement élaborée et étendue dans ce protocole complet. Auparavant, il a été démontré qu’aussi peu que ~2-10 mg de tissu musculaire de poids humide est suffisant pour la lyophilisation et l’analyse de la protéine isoforme du CMH à fibre unique9. Christensen et al.9 ont utilisé 30 % d’un segment de fibre de ~1 mm pour détecter l’isoforme du CMH présente par transfert de points, ce qui a été confirmé par transfert Western. Ce travail a montré qu’en remplaçant le western blot par le transfert de points, les coûts globaux étaient réduits de ~40 fois (pour 50 segments de fibres). Les fibres ont ensuite été « regroupées » en échantillons de type I et de type II, ce qui a permis une réplication expérimentale9. Néanmoins, une limite était que seuls deux échantillons spécifiques au type de fibre ont été obtenus : le type I (MHCI positif) et le type II (fibres MHCII positives), les échantillons de type II contenant un mélange de MHCIIa et de MHCIIx 6,10. Notamment, le protocole actuel montre comment les fibres pures de type IIx peuvent être identifiées et fournit un flux de travail très détaillé (résumé dans la figure 1), y compris des stratégies de dépannage pour les problèmes de protocole courants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Collecte de fibres
Sur la base de plusieurs années d’expérience, la plupart des chercheurs peuvent maîtriser cette technique ; Cependant, la pratique permet une collecte plus rapide et plus efficace des fibres pour les analyses en aval. Pour pouvoir isoler 30 segments de fibres simples d’une qualité pour la mise en commun, il est recommandé de prélever 50 segments de fibres par échantillon. Il est recommandé d’étudier attentivement la vidéo de collecte de fibres et après avoir effectu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les anticorps contre le CMH I (A4.840) et le MHCIIa (A4.74) utilisés dans cette étude ont été développés par le Dr H. M. Blau et l’anticorps contre MHCIIx (6H1) a été développé par le Dr C. A. Lucas et obtenu auprès de la Banque d’études sur les hybridomes du développement (DSHB), grâce aux auspices de l’Institut national de la santé de l’enfant et du développement humain et maintenu par l’Université de l’Iowa. Département des sciences biologiques (Iowa City, IA). Nous remercions Victoria L. Wyckelsma d’avoir fourni les échantillons de muscles humains pour cette étude. La majorité des images de la figure 1 proviennent de BioRender.com.
Financement:
Cette étude n’a reçu aucun financement externe.
Materials
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
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