تحديد نوع الألياف للعضلات الهيكلية البشرية
Summary
يوضح هذا البروتوكول عزل الألياف المفردة من العضلات الهيكلية البشرية المجففة بالتجميد وتصنيف نوع الألياف وفقا لسلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) باستخدام تقنية النشاف النقطية. يمكن بعد ذلك تحليل عينات الألياف MHC I و II المحددة بشكل أكبر بحثا عن الاختلافات الخاصة بنوع الألياف في تعبير البروتين باستخدام النشاف الغربي.
Abstract
يمكن استخدام التقنية الموصوفة هنا لتحديد أشكال متماثلة محددة من سلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) في أجزاء من ألياف العضلات الفردية باستخدام النشاف النقطي ، ويشار إليها فيما يلي باسم اكتشاف سلسلة الأوسينالثقيلة الخاصة بي بواسطة Dot Blotting لتحديد معرفنوع الألياف العضلية (MyDoBID). يصف هذا البروتوكول عملية تجفيف العضلات الهيكلية البشرية بالتجميد وعزل أجزاء من ألياف العضلات المفردة. باستخدام MyDoBID ، يتم تصنيف الألياف من النوع الأول والثاني مع الأجسام المضادة الخاصة ب MHCI و IIa ، على التوالي. ثم يتم دمج الألياف المصنفة في عينات خاصة بنوع الألياف لكل خزعة.
يتم تحديد البروتين الكلي في كل عينة بواسطة الرحلان الكهربائي لثنائي الصوديوم – كبريتات بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) وتقنية الجل المنشط بالأشعة فوق البنفسجية. يتم التحقق من صحة نوع الألياف من العينات باستخدام النشاف الغربي. كما تم وصف أهمية إجراء تطبيع تحميل البروتين لتعزيز اكتشاف البروتين المستهدف عبر البقع الغربية المتعددة. تشمل فوائد دمج الألياف المصنفة في عينات خاصة بنوع الألياف مقارنة بالبقع الغربية أحادية الألياف ، تعدد استخدامات العينات ، وزيادة إنتاجية العينة ، واستثمار وقت أقصر ، وتدابير توفير التكاليف ، كل ذلك مع الاحتفاظ بمعلومات قيمة خاصة بنوع الألياف والتي غالبا ما يتم تجاهلها باستخدام عينات العضلات المتجانسة. الغرض من البروتوكول هو تحقيق تحديد دقيق وفعال للألياف من النوع الأول والنوع الثاني المعزولة من عينات العضلات الهيكلية البشرية المجففة بالتجميد.
يتم دمج هذه الألياف الفردية لاحقا لإنشاء عينات خاصة بنوع الألياف من النوع الأول والنوع الثاني. علاوة على ذلك ، تم توسيع البروتوكول ليشمل تحديد ألياف النوع IIx ، باستخدام الأكتين كعلامة للألياف التي كانت سلبية ل MHCI و MHCIIa ، والتي تم تأكيدها على أنها ألياف IIx بواسطة النشاف الغربي. ثم يتم استخدام كل عينة خاصة بنوع الألياف لتحديد التعبير عن البروتينات المستهدفة المختلفة باستخدام تقنيات النشاف الغربية.
Introduction
العضلات الهيكلية هي نسيج غير متجانس ، مع خصائص التمثيل الغذائي وانقباض الخلوية المتميزة التي تعتمد على ما إذا كانت الخلية (الألياف) هي نشل بطيء (النوع الأول) أو نشل سريع (النوع الثاني). يمكن التعرف على نوع الألياف من خلال فحص الأشكال المتساوية لسلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) ، والتي تختلف عن بعضها البعض بعدة طرق ، بما في ذلك وقت الانكماش وسرعة التقصير ومقاومة التعب1. تشمل الأشكال المتساوية الرئيسية MHC النوع الأول والنوع IIa والنوع IIb والنوع IIx وتكون ملامحها الأيضية إما مؤكسدة (النوع الأول و IIa) أو تحلل السكر (IIx ، IIb) 1. تختلف نسبة أنواع الألياف هذه في نوع العضلات وبين الأنواع. تم العثور على النوع IIb على نطاق واسع في عضلات القوارض. لا تحتوي عضلات الإنسان على أي ألياف من النوع IIb وتتكون في الغالب من ألياف MHC من النوع الأول و IIa ، مع نسبة صغيرة من ألياف IIx2. تختلف ملامح تعبير البروتين بين أنواع الألياف المختلفة ويمكن تغييرها مع الشيخوخة3 ، وممارسة4،5 ، والمرض6.
غالبا ما يتم تجاهل قياس الاستجابات الخلوية في أنواع مختلفة من الألياف العضلية الهيكلية أو غير ممكن بسبب فحص تجانس العضلات (مزيج من جميع أنواع الألياف). تسمح اللطخة الغربية أحادية الألياف بفحص البروتينات المتعددة في ألياف العضلات الفردية7. تم استخدام هذه المنهجية سابقا لإنتاج خصائص ألياف مفردة جديدة وغنية بالمعلومات لم يكن من الممكن الحصول عليها باستخدام مستحضرات متجانسة. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على منهجية اللطخة الغربية الأصلية أحادية الألياف ، بما في ذلك الطبيعة التي تستغرق وقتا طويلا ، وعدم القدرة على توليد نسخ متماثلة للعينات ، واستخدام كواشف التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) باهظة الثمن والحساسة. إذا تم استخدام الأنسجة الطازجة ، فإن هذه الطريقة محدودة بشكل أكبر بسبب القيود الزمنية للحاجة إلى عزل الألياف الفردية في إطار زمني محدود (أي 1-2 ساعة). لحسن الحظ ، يتم تخفيف هذا التقييد عن طريق عزل شرائح الألياف المفردة من الأنسجة المجففةبالتجميد 8. ومع ذلك ، فإن جمع الألياف من العينات المجففة بالتجميد محدود بحجم وجودة الأنسجة المأخوذة.
تم توضيح تحديد نوع الألياف باستخدام طريقة النشافالنقطي 9 بشكل كبير وتوسيعه في هذا البروتوكول الشامل. في السابق ، ثبت أن أقل من ~ 2-10 ملغ من الأنسجة العضلية ذات الوزن الرطب كافية للتجفيف بالتجميد وتحليل البروتين أحادي الألياف MHC9. استخدم Christensen et al.9 30٪ من قطعة ألياف ~ 1 مم للكشف عن شكل MHC الموجود عن طريق النشاف النقطي ، وهو ما أكده النشاف الغربي. أظهر هذا العمل أنه من خلال استبدال النشاف الغربي بالنشاف النقطي ، تم تخفيض التكاليف الإجمالية بمقدار ~ 40 ضعفا (ل 50 قطعة ألياف). ثم تم “تجميع” الألياف في عينات من النوع الأول والنوع الثاني ، مما سمح بالتكرار التجريبي9. ومع ذلك ، كان هناك قيد هو أنه تم الحصول على عينتين فقط من نوع الألياف: النوع الأول (MHCI إيجابي) والنوع الثاني (الألياف الإيجابية MHCII) ، مع عينات من النوع الثاني تحتوي على خليط من MHCIIa و MHCIIx 6,10. والجدير بالذكر أن البروتوكول الحالي يوضح كيف يمكن تحديد الألياف النقية من النوع IIx ويوفر سير عمل مفصل للغاية (ملخص في الشكل 1) ، بما في ذلك استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمشكلات البروتوكول الشائعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
جمع الألياف
بناء على عدة سنوات من الخبرة ، يمكن لمعظم الباحثين إتقان هذه التقنية. ومع ذلك ، تؤدي الممارسة إلى جمع الألياف بشكل أسرع وأكثر كفاءة للتحليلات النهائية. لتكون قادرا على عزل 30 قطعة ألياف مفردة بجودة التجميع ، يوصى بجمع 50 قطعة ألياف لكل عينة. يوصى بدراسة فيديو جمع الأليا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تطوير الأجسام المضادة ضد MHC I (A4.840) و MHCIIa (A4.74) المستخدمة في هذه الدراسة من قبل الدكتور H. M. Blau وتم تطوير الجسم المضاد ضد MHCIIx (6H1) من قبل الدكتور C. A. Lucas وتم الحصول عليه من بنك الدراسات التنموية Hybridoma (DSHB) ، وذلك بفضل رعاية المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية وتحتفظ به جامعة أيوا ، قسم العلوم البيولوجية (أيوا سيتي ، IA). نشكر Victoria L. Wyckelsma على تقديم عينات العضلات البشرية لهذه الدراسة. تم الحصول على غالبية الصور في الشكل 1 من BioRender.com.
التمويل:
ولم تتلق هذه الدراسة أي تمويل خارجي.
Materials
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
- Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
- Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
- Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
- Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
- Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
- Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
- Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
- Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
- Bergstrom, J. Muscle electrolytes in man. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
- Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
- Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
